학술논문
Functional Analysis of Human Methyl-CpG Binding Protein 2 by RNA Silencing and Drosophila Model System / RNA silencing과 초파리 모델 시스템을 이용한 인간 Methyl-CpG Binding Protein 2 (hMeCP2)의 기능 분석
Document Type
Dissertation/ Thesis
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English
Abstract
Methyl-CpG binding protein 2 (MeCP2) is a ubiquitous epigenetic factor thatrepresses gene expression by modifying chromatin. Mutations in the MECP2 genecause Rett syndrome (RTT), a progressive neurodevelopmental disorder. Recentstudies have identified a novel role for MeCP2 in carcinogenesis. Specifically,functional ablation of MeCP2 suppresses cell growth and proliferation of cancercells. However, MeCP2’s function in adult tissues remains poorly understood.Therefore, the present study investigated the role of human MeCP2 (hMeCP2)using RNA silencing and transgenic adult Drosophila midgut.First, MeCP2 expression was silenced using annealed siRNA in HEK293 cells,and then a cDNA microarray was performed. Among the differentially expressedgenes with a change in expression greater than two-fold, 189 genes were upregulatedand 91 genes were down-regulated. Genes related to apoptosis and cellproliferation (JUN, FOSL2, CYR61, SKIL, ATF3, BMABI, BMPR2, RERE, andFALZ) were highly up-regulated. Genes with anti-apoptotic and anti-proliferativefunctions (hnRPA0, HIS1, and FOXC1) were down-regulated. Using transcriptionfactor binding site (TFBS) analysis within putative promoters of novel candidatetarget genes of MeCP2, tumorigenesis-related transcription factors (TFs) wereidentified.Next, the role of hMeCP2 in adult stem cells was investigated in adult Drosophilamidgut, an excellent model system for stem-cell biology. For the purpose,transgenic flies with exogenic hMeCP2 were generated. The transgenic fly UAShMeCP2expressed hMeCP2, which was able to bind to both euchromatin andheterochromatin in Drosophila cells. hMeCP2 overexpression in ECs but notISCs/EBs induced ISCs proliferation, which was associated with the activation of JNK in ECs and ERK and AKT signaling in ISC/EB progenitors. Furthermore,overexpressed hMeCP2 in ECs modulated HP1 distribution and caused genomicinstability in ISCs/EBs as well as ECs.The present results provide insights into the function of MeCP2 in stem cellhomeostasis and carcinogenesis.
Methyl-CpG binding protein 2 (MeCP2)는 후생유전인자로서, 염색질을 변형시켜서유전자 발현을 조절한다. MECP2 유전자에 돌연변이가 생기면 진행성 신경발달 장애중 하나인 Rett 증후군 (RTT)이 발생한다. 최근에는 암 조직에서 MeCP2의 높은 발현이 보고되고 있으며 신경발생학적 질병과 암 발생에 있어서 성체줄기세포의 중요성이알려지고 있다. 그러나 RTT 및 다른 질환의 발생과 관련한 MeCP2의 다양한 역할은아직 잘 밝혀져 있지 않다. 따라서, 본 연구에서 human cell과 성체줄기세포에서 인간MeCP2 (hMeCP2)의 RNA silencing 및 형질전환 초파리의 소장을 이용하여 후생유전인자인 MeCP2의 기능을 조사하고자 하였다.RNA silencing에 의한 hMeCP2의 기능 분석에 있어서는 HEK293 세포에 smallinterfering RNA (siRNA)를 처리하여 hMeCP2 발현을 억제한 후에 cDNA microarray 분석을 실시하였다. HEK293에서 hMeCP2 유전자 silencing 후에 2배 이상 발현이 증가한유전자는 189개였으며, 91개는 발현이 절반 이하로 감소하였다. 그 중 4배 이상의 발현 증가를 보이는 유전자는 세포증식 (proliferation)과 사멸 (apoptosis)에 관련된 유전자에 해당하였다. hMeCP2에 의해 조절되는 하위유전자를 대상으로 이미 알려진MeCP2의 표적유전자와의 전사인자결합위치 (TFBS)를 분석하여 유사한 유전학적 네트워크에 의해 조절되고 있음을 확인하였다. 따라서 hMeCP2에 의해 발현의 차이를 보인 세포증식과 사멸에 관여하는 유전자들이 hMeCP2의 새로운 표적 유전자인 것으로예상된다.유전학적 모델로 잘 알려진 초파리에서 hMeCP2의 기능 분석을 위해, hMeCP2를 삽입하여 형질전환초파리를 제작하였고 장줄기세포에서의 hMeCP2의 역할을 조사하였다.초파리 소장에서 줄기세포 증식을 조사한 결과, 미분화된 장줄기세포 (intestinal stemcell, ISC)에서의 hMeCP2 과발현은 그 효과를 관찰할 수 없었으나 분화된 장상피세포(enterocyte, EC)에서 hMeCP2의 과발현에 의해 장줄기세포의 증식이 증가하는 것을확인하였다. 또한, 분화된 장상피세포에서 hMeCP2 과발현에 의해 장세포에서 HP1의분포가 달라지는 것을 확인하였으며, 세포사멸을 유도하는 것으로 알려진 JNK를 활성화시켰다. 또한, 분화된 장상피세포의 hMeCP2 과발현이 장줄기세포에서 세포증식관련인자인 ERK, AKT 및 DNA damage 마커인 γH2AvD를 증가시킴을 확인하였다. 이는분화된 장상피세포에서 hMeCP2의 과발현은 후생유전학적 유전자들의 발현을 조절하고 사멸을 촉진함으로써 장줄기세포의 증식과 DNA 손상 축적을 유도한다는 새로운사실을 알 수 있었다.MeCP2의 새로운 기능에 관한 이상의 연구결과들은 줄기세포 항상성 유지 및 발암기전 이해에 중요한 기초정보로 활용될 수 있을 것이다.
Methyl-CpG binding protein 2 (MeCP2)는 후생유전인자로서, 염색질을 변형시켜서유전자 발현을 조절한다. MECP2 유전자에 돌연변이가 생기면 진행성 신경발달 장애중 하나인 Rett 증후군 (RTT)이 발생한다. 최근에는 암 조직에서 MeCP2의 높은 발현이 보고되고 있으며 신경발생학적 질병과 암 발생에 있어서 성체줄기세포의 중요성이알려지고 있다. 그러나 RTT 및 다른 질환의 발생과 관련한 MeCP2의 다양한 역할은아직 잘 밝혀져 있지 않다. 따라서, 본 연구에서 human cell과 성체줄기세포에서 인간MeCP2 (hMeCP2)의 RNA silencing 및 형질전환 초파리의 소장을 이용하여 후생유전인자인 MeCP2의 기능을 조사하고자 하였다.RNA silencing에 의한 hMeCP2의 기능 분석에 있어서는 HEK293 세포에 smallinterfering RNA (siRNA)를 처리하여 hMeCP2 발현을 억제한 후에 cDNA microarray 분석을 실시하였다. HEK293에서 hMeCP2 유전자 silencing 후에 2배 이상 발현이 증가한유전자는 189개였으며, 91개는 발현이 절반 이하로 감소하였다. 그 중 4배 이상의 발현 증가를 보이는 유전자는 세포증식 (proliferation)과 사멸 (apoptosis)에 관련된 유전자에 해당하였다. hMeCP2에 의해 조절되는 하위유전자를 대상으로 이미 알려진MeCP2의 표적유전자와의 전사인자결합위치 (TFBS)를 분석하여 유사한 유전학적 네트워크에 의해 조절되고 있음을 확인하였다. 따라서 hMeCP2에 의해 발현의 차이를 보인 세포증식과 사멸에 관여하는 유전자들이 hMeCP2의 새로운 표적 유전자인 것으로예상된다.유전학적 모델로 잘 알려진 초파리에서 hMeCP2의 기능 분석을 위해, hMeCP2를 삽입하여 형질전환초파리를 제작하였고 장줄기세포에서의 hMeCP2의 역할을 조사하였다.초파리 소장에서 줄기세포 증식을 조사한 결과, 미분화된 장줄기세포 (intestinal stemcell, ISC)에서의 hMeCP2 과발현은 그 효과를 관찰할 수 없었으나 분화된 장상피세포(enterocyte, EC)에서 hMeCP2의 과발현에 의해 장줄기세포의 증식이 증가하는 것을확인하였다. 또한, 분화된 장상피세포에서 hMeCP2 과발현에 의해 장세포에서 HP1의분포가 달라지는 것을 확인하였으며, 세포사멸을 유도하는 것으로 알려진 JNK를 활성화시켰다. 또한, 분화된 장상피세포의 hMeCP2 과발현이 장줄기세포에서 세포증식관련인자인 ERK, AKT 및 DNA damage 마커인 γH2AvD를 증가시킴을 확인하였다. 이는분화된 장상피세포에서 hMeCP2의 과발현은 후생유전학적 유전자들의 발현을 조절하고 사멸을 촉진함으로써 장줄기세포의 증식과 DNA 손상 축적을 유도한다는 새로운사실을 알 수 있었다.MeCP2의 새로운 기능에 관한 이상의 연구결과들은 줄기세포 항상성 유지 및 발암기전 이해에 중요한 기초정보로 활용될 수 있을 것이다.