부산대학교 도서관

En esta tesis se han utilizado distintas estrategias para obtener el control en la producción y detección de diferentes especies reactivas de oxígeno (ROS), especialmente para el oxígeno singlete (1O2). En la primera parte de la tesis, el enfoque principal consiste en entender la generación de ROS e intentar potenciar su efecto. En primer lugar, demostramos que la modificación de distintos fotosensibilizadores, añadiendo un catión de trifenilfosfonio como elemento diana, produce derivados con una excelente actividad fotoantimicrobiana contra bacterias Gram-positivas (S. aureus y E. faecalis). En segundo lugar, descubrimos una serie de nuevos aspectos de la reacción de "-phenyl quenching" por derivados de 9-fenilfenalenona. La fototoxicidad de estos derivados ya se encuentra mencionada en el libro: "el origen de las especies" de C. Darwin. También se sugiere una vía metabólica mediada por la reacción BPQ en la biosíntesis de los pigmentos vegetales derivados de fluorenonas. Además, si el grupo fenilo es sustituido por otros grupos arilos, se observan diferencias en la reacción de BPQ. En tercer lugar, se ha demostrado que distintas antraquinonas de origen natural inducen fototoxicidad en biofilms de C. tropicalis debido a la generación de O2•, teniendo el 1O2 un rol menor. En cuarto lugar, se demuestra que el fármaco antitumoral Doxorubicina produce cantidades significantes de 1O2, pero se reduce su generación cuando se compleja con el ADN. En quinto lugar, se ha estudiado el efecto de adsorción o unión covalente de un fotosensibilizador a nanopartículas mesoporosas de sílice. Además, se han derivatizado para añadir elementos diana. Sexto y último, se han estudiado las propiedades fotoquímicas de una nueva diada que contiene un bromo-bodipy como fotosensibilizador y trampa química de ROS (que desactiva la capacidad del bromo-bodipy para generar 1O2). Una vez oxidada la trampa química, la diada recupera la capacidad para generar 1O2 y causar daño celular. Se observan diferentes propiedades foto-antitumorales de esta diada en función del estrés celular o de la localización celular. La segunda parte de la tesis, se ha centrado en la detección de ROS. En primer lugar, se han diseñado, sintetizado y caracterizado nanosondas fluorescentes para la detección de 1O2 en sistemas biológicos. La nanovehiculización elimina algunas de las limitaciones de las distintas sondas fluorescentes de 1O2. En este sentido, varias sondas tales como SOSG, ADPA o furilo-vinilo-naftooxazol se han unido covalentemente a nanopartículas utilizando distintas cadenas espaciadoras para optimizar su reactividad frente 1O2. A diferencia de cuando se encuentran libres en solución, las nanosondas son fácilmente internalizadas por células eucariotas y procariotas y se minimiza la interacción con proteínas (como por ejemplo con la albúmina de suero bovino). Las distintas nanosondas responden al 1O2 generado intracelular. Como prueba de concepto, también se ha desarrollado una nanosonda fluorescente para la detección no selectiva de ROS, basada en 2',7'-diclorodihidrofluoresceina. En segundo lugar, se ha caracterizado la estructura y reactividad de la sonda fluorescente: CellROX Deep Red. En tercer lugar, se ha desarrollado la primera sonda de optoacústica para la detección de ROS basada en la oxidación de la tetrametilbenzidina. Se ha logrado detectar 1O2 producido por bacterias emprando tal sonda. Finalmente, y como prueba de concepto, se ha diseñado un "self-reporter" nanofotosensibilitzador. El nanosistema es capaz de producir y detectar 1O2 simultáneamente. Este nanodispositivo ha sido utilizado con éxito para la fotoinactivación de S. aureus, observándose una correlación entre el cambio de fluorescencia de la sonda y la muerte bacteriana.
In this thesis, different strategies have been used in order to gain control in reactive oxygen species (ROS) production and detection, especially for singlet oxygen (1O2). In the first part of the thesis, the main focus is towards understanding ROS generation and try to potentiate its effect. First, we demonstrate that modification of different photosensitisers with the triphenylphosphonium cation yields derivatives with an excellent photoantimicrobial activity against Gram‐positive bacteria (i.e., S. aureus and E. faecalis). Second, we uncover a number of new aspects of -phenyl quenching reaction in 9-phenylphenalenone scaffold, whose phototoxicity was already mentioned in Darwin’s Origin of Species. It is suggested an excited state-mediated metabolic pathway in the biosynthesis of fluorone plant pigments. Moreover, if phenyl moiety is substituted for other aryl groups, it is observed that the electrocyclic ring opening back to ground state ketones have lifetimes between miliseconds and picoseconds. Third, we demonstrate that the main photosensitizing mechanism, involved in the photo-induced C. tropicalis antibiofilm activity by natural anthraquinones, is via O2• production, whereas 1O2 participation seems of lesser importance. Fourth, we demonstrate that doxorubicin produces significant amounts of 1O2, however, this is largely suppressed when bound to DNA. Fifth, we studied the effect of PS adsorption or covalently bond onto the surface of mesoporous silica nanoparticles. Moreover, we further derivatitze them for attach targeting elements. Sixth and last, we studied the activation a new dyad comprising a bromo-bodipy, which acts as PS, plus a non-selective ROS chemical trap, which quenches the ability of bromo-bodipy to produce 1O2. For that aPS we observe a differential behaviour in function of the cellular stress or even in function of the organelle. In the second part of the thesis, focus has been shifted towards ROS detection. First, we designed, synthesized, and characterized biocompatible fluorescent nanoprobes for 1O2 detection in biological systems that circumvents many of the limitations of the different molecular 1O2 fluorescent probes. Under that purpose different 1O2 probes (Singlet Oxygen Sensor Green, anthracene dipropionic acid and furyl-vinyl-naphthoxazole) were covalently linked to nanoparticles core using different architectures to optimize their response to 1O2. In contrast to its molecular counterpart, the optimum nanoprobes are readily internalized by prokaryotic and eukaryotic cells and they do not interact with proteins (i.e. bovine serum albumin). Furthermore, the spectral characteristics do not change inside cells, and the probe responds to intracellular generated 1O2 with the corresponding change in fluorescence. As a proof of concept, a non-selective ROS fluorescent nanoprobe, based on diacetyl 2’,7’-dichlorodihydrofluorescein, has been synthetized and successfully used for detecting intracellular ROS. Second, we have performed the chemical characterization of the CellROX Deep Red, a new commercial non-selective ROS fluorescent probe, ascertained its putative chemical structure and evaluated its reactivity towards different reactive oxygen/nitrogen species and light in solution. Third, we developed the first ROS optoacoustic probe based on the oxidation of tetramethylbenzidine and successfully used for detecting 1O2 produced by bacteria. Finally, as proof of concept we have designed a self-reporter nanophotosensitizer. The nanosystem is capable to produce and detect the 1O2 generated simultaneously. It has been successfully used for S. aureus photoinactivation in which a correlation was observed between fluorescent change of the probe and bacterial cellular death.