학술논문
Structural studies of Heteromeric Amino acid Transporters (HATs): Validation of the first 3D structural model of a HAT (human 4F2hc/LAT2) and identification of new HAT targets for 3D‐crystallization
Document Type
Dissertation/Thesis
Author
Source
TDX (Tesis Doctorals en Xarxa)
Subject
Language
English
Abstract
Los transportadores heteroméricos de aminoácidos (HAT) median el transporte de aminoácidos a través de la membrana plasmática. Representan el único ejemplo de transportadores de solutos formado por dos subunidades distintas unidas por un puente disulfuro. Debido a su gran relevancia en fisiología (asociados a aminoacidurias, infección por virus, cáncer,…) el estudio de su estructura-función resulta clave. Debido a su naturaleza, son proteínas difíciles de cristalizar, de las que sólo se conoce la estructura atómica del ectodominio de 4F2hc humano. En este escenario la tesis se centró en la validación del primer modelo 3D a baja resolución de un HAT humano (4F2hc/LAT2), mediante experimentos de crosslinking entre subunidades, e identificación de nuevos candidatos para cristalización 3D. Para ello se seleccionaron 24 subunidades ligeras de distintas especies eucariotas y se testaron en un proceso de selección para determinar el/los mejores candidatos. El primer objetivo de la tesis concluyó con la determinación de residuos concretos en 4F2hc y LAT2 cercanos a una distancia de 3-14 Å mediante la utilización de crosslinkings de cisteínas. Finalmente, tres líneas distintas: el modelo 3D obtenido por microscopía electrónica de transmisión y tinción negativa de partículas individuales (en colaboración con Dr. Fotiadis), los experimentos de crosslinking, y el docking generado en colaboración con Dr. Fdz-Recio, demostraron que 4F2hc-ED cubre, casi completamente, la superficie extracelular de LAT2. Además, se demostró que el ectodominio de 4F2hc es suficiente para estabilizar LAT2. Como resultados del segundo objetivo, tres subunidades ligeras fueron seleccionadas, tras adaptar el protocolo desarrollado por Drew et al.,2008, como mejores candidatas para estudios de cristalización 3D. Posteriormente, distintas estrategias se siguieron para mejorar la estabilidad de la mejor candidata: eliminación de la cisteína reactiva, adición de lípidos a la muestra, cambio de sistema de expresión para aumentar su expresión a células de insecto Sf9. Además, se generaron mutantes delecionados en N y C terminal para reducir su flexibilidad y aumentar la probabilidad de cristalización. Se concluyó en encontrar un buen candidato para estudios de cristalización.