부산대학교 도서관

최근 항생제 오남용으로 인해 다제내성균이 출현하는 등 항생제 내성 균주의 출현이 세계적 공중보건 문제로 주목받아 항생제 사용을 줄이기 위한 대체제 개발 연구에 대한 수요가 급증하였다. 또한, 다수의 선행연구에서는 발효식품이 전신 건강 및 면역에 유익한 영향을 끼치는 프로바이오틱스의 훌륭한 공급원이라고 밝히고 있으며, 프로바이오틱스의 대표주자인 유산균이 생산하는 박테리오신은 항생제의 잠재적 대체제로 주목되어 많은 연구자에 의해 연구되고 있다. 한국의 대표 발효식품인 김치는 Companilactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Levilactobacillus, Secundilactobacillus 및 Weissella 속 등의 다양한 유산균의 표준균주 분리 원으로, 발효 기간에 따라 다양한 속의 유산균이 분포하고 있는 것으로 보고되어 있다. 또한, 김치에서 유래한 유산균의 항균 활성 및 항산화 효과가 보고되는 등 김치는 다양한 기능성 유산균의 공급원으로 잘 알려져 있다. 김치에서 유래한 Pediococcus 속의 유산균은 박테리오신을 생산하며, 장내 유해 세균의 부착을 저해하는 등의 효과가 연구되어, 지속적인 연구가 진행될 경우, 기능성 소재로서 개발 가능성이 높을 것으로 판단된다. 하지만 지금까지의 김치 유래 Pediococcus 속 연구는 균종이 한정적일 뿐 아니라 기초연구가 부족한 실정이다. 이에 본 연구에서는 다양한 기능성 유산균 공급원인 김치에서 다제내성 녹농균에 대한 항균 및 생물막 형성 억제 활성이 있는 유산균을 분리하여, 항생제 내성 녹농균에 의한 감염증을 예방 또는 치료하는 효과가 있는 기능성 소재로의 개발 가능성을 평가하고자 하였다. 김치에서 분리한 유산균의 다제내성 녹농균에 대한 항균력을 검정하기 위해 유산균 배양액의 무세포 상등액(cell-free supernatant, CFS)을 이용하여 항균 활성 및 생물막 형성 억제 효과를 확인하였다. 이후 배양시간에 따른 생육패턴 및 기능성 평가를 실시하였으며, 대사물질 분석을 통해 항균효과를 보이는 물질을 동정하였다. 김치에서 분리한 유산균 K30, K32 및 K35의 무세포 상등액은 다제내성 녹농균의 생육 및 생물막 형성을 상당히 억제하는 것으로 확인되었으며, 16S rRNA 염기서열 분석을 통해 Pediococcus inopinatus로 동정하였다. 상기 항균 및 생물막 형성 억제 활성 실험과 균주 동정 결과를 종합하였을 때, 기능성 소재로서 개발 잠재력이 가장 높은 균주 K35를 선발하였으며, 생육 패턴 분석, 항균 활성 시험, 생물막 형성 억제 시험 및 안전성 평가를 수행하였다. P. inopinatus K35는 MRS broth에서 가장 우수한 생육 및 항균효과를 나타냈으며 녹농균에 대한 항균 활성은 접종 후 48시간 배양한 시료에서 최대였다. 반면 생물막 형성 억제 활성은 접종 후 6시간 배양한 시료부터 급격히 증가하여 12시간 배양한 시료에서 가장 높은 활성을 보였다. 안전성 평가에서 P. inopinatus K35는 용혈을 일으키지 않았고, bile salt를 deconjugation 시키지 않는 등 대부분의 평가 항목에서 안전성이 확인되었으나, 항생제 내성 평가에서 kanamycin에 대한 기준치 이상의 항생제 내성이 확인되었다. 따라서 향후 프로바이오틱스로 활용하고자 한다면 유전체를 분석하여 항생제 내성 유전자의 획득성 또는 내제성 여부를 판단해야 할 것으로 사료된다. P. inopinatus K35의 항균효과가 어떤 물질에서 비롯되는지 확인하기 위하여 효소를 처리한 시료의 항균효과를 분석하였다. 그 결과 proteinase K를 처리한 군에서 항균 활성의 감소가 확인되어, P. inopinatus K35의 항균효과는 박테리오신 유사물질에 의한 것으로 판단하였다. 이후 P. inopinatus K35가 생산하는 박테리오신을 특정하고자 UPLC-QTOF-MS로 배양액을 분석한 결과 curacin A 및 pediocin A가 검출되었다. 이 중 pediocin A가 선행연구에서 다양한 그람음성균에 대한 항균효과를 나타낼 수 있는 물질인 것으로 확인됨에 따라, 본 연구에서 분리한 균주 P. inopinatus K35의 항균효과는 pediocin A를 포함한 박테리오신에 기인한 것으로 판단하였다. 본 연구에서는 김치 유래 유산균 P. inopinatus K35의 다제내성 녹농균에 대한 항균 및 생물막 형성 억제 효과를 확인할 수 있었으며, 이러한 효과가 pediocin A를 포함한 박테리오신에 기인하는 것으로 판단하였다. 연구 결과에 따라 김치는 항생제 내성균의 감염증과 그에 관련된 질병을 관리하는 데 도움을 주는 유익균의 우수한 공급원이 될 수 있을 것으로 생각되며, 본 연구에서 분리한 유산균 P. inopinatus K35의 항균물질 생산 및 적용을 위한 추가연구가 진행된다면 항생제 내성 녹농균에 의한 감염증을 예방 또는 치료하는 효과가 있는 기능성 소재로서 개발 가능성이 충분할 것으로 사료된다.
Recently, the emergence of multidrug-resistant bacteria due to the misuse of antibiotics has attracted attention as a global public health problem. Many studies have found that fermented foods are good sources of probiotics that are beneficial to the human immune system. Therefore, in this study, a substance for the safe alternative treatment of multidrug-resistant bacterial infections was sought in Kimchi, a traditional fermented food from Korea. Antimicrobial and anti-biofilm activities were assessed against multidrug-resistant (MDR) Pseudomonas aeruginosa using cell-free supernatants (CFS) of lactic acid bacteria (LAB) isolated from Kimchi. Then, growth pattern and antimicorbial effects were confirmed using cultured time, safety test and UPLC-QTOF-MS analysis was performed to detect to detect the substances responsible for the antimicrobial effect. The CFS of strain K30, K32 and K35 isolated from Kimchi effectively inhibited the growth of MDR P. aeruginosa. Similarly, CFS from strains K30, K32, and K35 combined with P. aeruginosaco-cultures significantly inhibited biofilm formation upon testing. On the basis of 16s rRNA gene sequence similarity, strains K30, K32 and K35 were identified as Pediococcus inopinatus. After conducting antimicrobial and anti-biofilm activity tests, the candidate strain K35 with the highest potential was selected, and growth pattern analysis, antimicrobial activity test, anti-biofilm test, and safety evaluation were conducted. As a result of optimal culture broth test P. inopinatus K35 showed the best growth and antimicrobial effect in MRS broth. Upon the optimal culture time test of K35, the antibacterial activity against P. aeruginosa was maximum after 48 hours of incubation, while its anti-biofilm activity rapidly increased after 6 h and reached a maximum after 12 h. A safety evaluation of strain K35 was conducted, but antibiotic resistance to kanamycin was confirmed in the antibiotic resistance test. Therefore, an additional safety evaluation should be performed for future use as probiotics. To determine the active substance responsible for the antimicrobial activity of P. inopinatus K35, analyzed enzyme-treated samples. Results showed that the sample treated with proteinase K lost antimicrobial effectiveness, suggesting the possible effects of a bacteriocin-like substance. UPLC-QTOF-MS analysis of the CFS of P. inopinatus K35 detected curacin A and pediocin A. Thus, it can be assumed that the antimicrobial and anti-biofilm effects shown in this study are due to bacteriocins such as curacin A and pediocin A. In conclusion, this study confirmed that P. inopinatus isolated from Kimchi significantly reduces MDR P. aeruginosa growth and biofilm formation. Hence, Kimchi may serve as a potential source of bacteria for managing diseases related to antibiotic-resistant infection.