부산대학교 도서관

Bacillus subtilis (고초균) 내 CodW peptidase와 CodX ATPase 기능을 함께하는 독특한 ATP-의존성 N-terminal serine protease인 CodWX는 단백질 분해 및 세포분열에 관여한다. 하지만 CodX분자구조 및 CodW–CodX의 복합체 구조가 아직 밝혀지지 않은 상태라서 이번 연구에서 처음으로 Escherichia coli HslU 결정구조의 상동성을 기반으로 ATPase CodX의 3차원 구조를 구축하였다. 게다가, 최근에 밝혀진 CodW–HslU hybrid 결정구조를 사용하여 생물학적으로 적절한 CodWX (W6W6X6) octadecamer 복합체 구조를 얻었다. 분자동력학 모의실험을 통해 CodWX 의 합리적이고 안정한 구조를 확인하였고, 뉴클레오티드 결합잔기들 및 GYVG pore 모티프 그리고 CodW–CodX interface와 같은 CodX N 및 C 도메인 내에 핵심 부분들의 분자적 활동 등을 관찰하였다. I 도메인의 예측된 구조는 대체로 coil형태를 띄고 기질이 결합하기에 적당한 hydrophobic region (M153–M206) 을 가지고 있어 유연하게 움직인다. 정전하분포 표면 관찰을 통해 전하상보성을 기초로 한 CodW–CodX 상호작용 패턴을 확인할 수 있었다. 이 패턴은 CodWX의 접촉면 내 가능한 본질적 상호작용 패턴일 수 있다. Glycine (G92 and G95) 잔기들의 유연성 및 보존된 Y93 방향족 고리 구조와 같은 CodX GYVG pore 모티프의 구조적 특징들을 통해 HslU 닫힌 상태 내에서 일어나는 단백질 분해 메커니즘과 비슷한 모드를 택할지도 모른다는 사실을 알 수 있었다. 이러한 결과들은 CodWX 복합체 내 CodX의 N 및 C 도메인이 중요하다는 것을 가리킨다. 새로운 CodWX octadecamer 모델은 타깃 단백질이 결합하고 들어가기 위한 가장 잠재적인 위치를 조사하기 위해 사용되었다. 인슐린 B chain 과 CodWX간의 분자 도킹 모의실험 결과들에서 I 도메인의 맨윗부분에 기질 결합을 위해 가장 적절한 소수성 위치를 확인하였고, I 도메인 내 핵심 상호작용 잔기들 (P204-M215)을 밝혀냈다. 이 CodWX-인슐린 B chain 복합체의 정전하 계산을 통해 어떻게 이 단백질의 소수성, 표면 상보성 그리고 전하 분포 등이 기질이 풀리고 통과하는데 도움을 줄 수 있는지를 설명하였다. 이런 결과들은 훌륭하게도 처음으로 ATPase-의존성 단백질 풀림 및 통과 메커니즘에 관한 가설을 설명할 수 있게 해준다. 구조기반 pharmacophore 모델들을 사용하여 CodWX 복합체를 위한 잠재적 억제제들을 개발하였다. 이러한 분자 모델링 연구 결과들은 고초균의 CodWX-의존성 단백질 분해 메커니즘을 이해하기 위한 중요한 정보들을 제공한다.
In Bacillus subtilis, CodW peptidase and CodX ATPase function together as a distinctive ATP-dependent N-terminal serine protease called CodWX, which participates in protein degradation and regulates cell division. The molecular structure of CodX and the assembly structure of CodW-CodX have not yet been resolved. Here, three-dimensional structure of CodX was constructed for the first time based on the crystal structure of homologous Escherichia coli HslU ATPase. Moreover, the biologically relevant CodWX (W6W6X6) octadecamer complex structure was obtained using the recently identified CodW–HslU hybrid crystal structure. Molecular dynamics simulation shows a reasonably stable structure of modeled CodWX complex and explicit behavior of key segments in CodX, functional domains (N-terminal (N), intermediate (I) and C-terminal (C)), nucleotide binding residues, GYVG pore motif and CodW-CodX interface. Predicted structure of the possible I domain is flexible in nature with highly coiled hydrophobic region (M153–M206) that could favor substrate binding and entry. Examination of electrostatic surface potential unveiled the charge complementarity based interaction pattern between CodW and CodX surfaces, which could be a possible native interaction pattern in the interface of CodW-CodX. Structural features of CodX GYVG pore motif, flexible nature of glycine (G92 and G95) residues and aromatic ring conformation preserved Y93 indicated that it may follow the similar mode during the proteolysis mechanism as in the HslU closed state. These results uncover the significance of CodX N and C domain in CodWX complex. The newly modeled CodWX octadecamer was further used to examine the nucleotide-dependent conformational changes and to find the most potential site for the protein substrate binding and entry. Nucleotide-dependent conformational changes in the I domain of CodX suggest that they could possibly play vital roles to regulate the protein unfolding-coupled translocation mechanism. Molecular docking simulations of CodWX with insulin B chain indicated the energetically most favorable hydrophobic site for the ligand binding at I domain apical side and revealed key interacting residues P204-M215 from I domain. Electrostatic calculation of this CodWX-insulin B chain complex illustrated how this protein's hydrophobicity, shape complementarity and charge distribution could possibly help in substrate unfolding and provide passage for their translocation. Remarkably, these findings lead me to hypothesize the ATPase-dependent protein unfolding-coupled translocation mechanism in CodWX for the first time. Furthermore, the present work employed the structure based pharmacophore modeling to identify multiple inhibitors that can interact with the CodWX and inhibit protein substrate entry, translocation and proteolysis. Results of these molecular modeling studies have significant implications for understanding the CodWX-dependent proteolysis mechanism of B. subtilis.