학술논문
Exploiting of the biosynthetic pathway of aminoglycoside istamycin and insight of 6’-N-methyltransferase IstU / 아미노글리코사이드 이스타마이신의 생합성 경로와 메틸전이효소 IstU의 기능 규명
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English
Abstract
The goal of this study was to elucidate the functions of the gene products at each step of the IST biosynthesis pathway. We take aim at two specific goals: First, identification the biosynthetic pathway for IST-FU-10, an intermediate biosynthetic pathway of istamycin. Second, confirmation the function of IstU, which is supposed to catalyze the 6'-N-methylation, a unique characteristic of the IST biosynthesis pathway.First, biosynthetic genes were selected through in silico analysis with alignment and artificially synthesized with optimized sequences according to codon usage in E. coli. The recombinant plasmids were introduced into the heterologous host E. coli BL21 (DE3). After each recombinant strain was cultured in liquid, the metabolites in the culture supernatant were confirmed by HPLC-ESI-MS/ MS. As a result, the biosynthesis of 2-deoxy-scyllo-inosose and 2-deoxy-scyllo-inosamine was confirmed in the recombinant strains containing the gene sets imrA-istC and imrA-istC-istS. Furthermore, the metabolism of NH7, NH8 and NH9, which was constructed by incorporating istM and istD, revealed that istM encodes a glycosyltransferase and istD encodes a deacetylase. In addition, it was confirmed that istM was biosynthesized through the biosynthetic pathway prior to istD, and finally IST-FU-10 was biosynthesized through 2'-N-acetyl-IST-FU-10.Next, according to the sequence alignment analyses, it was predicted that the istU gene encodes an N-methyltransferase. To characterize the function of IstU, the in vitro enzymatic reaction was carried out using gentamicin C1a and C2, which are closest to the structure of istamycin, as an alternative substrate, and 6’-N-methylation was found in both substrates. For further kinetic experiments, gentamicin C1a and C2 were chemically hydrolyzed into pseudo-disaccharides and neamine was prepared. As expected, the new 6’-N-methylated products were identified as compared with the control group, and several results were obtained through kinetic analysis. IstU is a biocatalyst for 6'-N-methylation in the biosynthesis pathway of istamycin and possesses the substrate flexibility within the range of di- to tri-saccharide types of AGA, while suggesting that it is necessarily influenced by the structural difference of the substrate.Although the complete pathway of istamycin could not be identified, the function of the genes for the core biosynthetic pathway could be elucidated. In particular, the results of the present study were the first to elucidate the biosynthetic pathway of istamycin through heterologous host expression, which has not been reported in the past, and can be the basis of the biosynthesis platform when determining the late stage of pathway. It is expected to be applied to metabolic engineering to improve productivity and contribute to new drug research and development.
본 연구는 아미노글리코사이드 항생제인 이스타마이신의 생합성경로 탐색을 위해 크게 두가지 목표를 설정하였다. 첫번째, 대장균을 이종 숙주로 이용하여 이스타마이신의 생합성 중간 대사체인 IST-FU-10에 대한 생합성 경로를 규명하고 두번째, 이스타마이신 생합성 경로 중 다른 아미노글리코사이드들과 구별되는 독특한 생합성 경로인 6’-N-메틸화를 촉매하는 것으로 추정되는 IstU의 기능을 확인하는 것이다.첫번째 목표를 위하여, 유전자들은 인실리코 분석을 통하여 선택되었고 인공 합성하였다. 유전자의 순차적인 조립에 따라 플라스미드를 구축하였고 이종 숙주 대장균 BL21(DE3)에 도입하여 대장균 재조합 균주를 제작하였다. 다음으로 각 재조합 균주를 액체배양한 후 배양 상층액 내의 대사체들을 HPLC-ESI-MS/MS 기기분석을 통하여 분석하였다. 그 결과, 상기 유전자 세트 imrA-istC와 imrA-istC-istS를 포함하는 재조합 균주 NH4, NH5에서 각각 2-deoxy-scyllo-inosose와 2-deoxy-scyllo-inosamine의 생합성을 확인하였다. 나아가, istM과 istD를 추가적으로 조립하여 만든 NH7, NH8 및 NH9의 대사체를 분석한 결과, istM은 당전이 효소를 암호화하고 istD는 탈아세틸효소를 암호화하고 있다는 것을 알 수 있었다. 또한 istM이 istD보다 앞서 생합성 경로에 작용하여 2’-N-acetyl-IST-FU-10을 거쳐 IST-FU-10이 최종적으로 생합성 됨을 확인했다.두번째 목표를 위하여, 이전에 밝혀진 메틸전이효소를 주형으로 한 인실리코 분석을 통해 istU 유전자가 N-메틸전이효소를 암호화하고 있다고 예측하였다. 이 IstU의 기능적 역할을 특성화하기 위해 이스타마이신의 구조에 가장 근접한 유사-삼당류인 겐타마이신 C1a 및 C2를 대안적인 기질로 사용하여 in vitro 효소 반응을 진행하였고, 두 기질에서 모두 6’-N-메틸화를 발견할 수 있었다. 나아가, 좀 더 유사한 기질을 이용한 동역학적 실험을 위해서 겐타마이신 C1a 과 C2를 화학적으로 가수분해하여 유사-이당류로 만들었고 상업적으로 구매가능한 neamine을 준비하였다. 그 결과, 대조군과 비교하여 6’-N-메틸화된 새로운 생성물을 확인하였고 IstU는 6’-N-메틸전달효소를 암호화하는 유전자임을 확인하였다. 또한 이-삼당류의 아미노글리코사이드 항생제의 범위 내에서 기질 유연성을 보이지만 6’-위치에 메틸기가 없으며 3’, 4’-위치에 수산기가 없는 기질을 선호함으로서, 기질의 구조적 차이에 의해 촉매 활성 및 효율에 영향을 받음을 알 수 있었다.이스타마이신 아미노글리코사이드 항생제의 완전한 경로를 밝혀내지는 못했지만, 이상의 결과를 통하여 전반적인 생합성 경로에 대한 유전자들의 기능을 규명할 수 있었다. 특히, 이종 숙주 발현을 통한 이스타마이신 관련 생합성 경로의 규명을 처음으로 이루었고 경로의 후기 단계를 결정할 때 생합성 플랫폼의 기초가 될 수 있으며, 생산성 향상을 위한 대사 공학에 적용되어 새로운 약제 연구 개발에 기여할 것으로 기대된다.
본 연구는 아미노글리코사이드 항생제인 이스타마이신의 생합성경로 탐색을 위해 크게 두가지 목표를 설정하였다. 첫번째, 대장균을 이종 숙주로 이용하여 이스타마이신의 생합성 중간 대사체인 IST-FU-10에 대한 생합성 경로를 규명하고 두번째, 이스타마이신 생합성 경로 중 다른 아미노글리코사이드들과 구별되는 독특한 생합성 경로인 6’-N-메틸화를 촉매하는 것으로 추정되는 IstU의 기능을 확인하는 것이다.첫번째 목표를 위하여, 유전자들은 인실리코 분석을 통하여 선택되었고 인공 합성하였다. 유전자의 순차적인 조립에 따라 플라스미드를 구축하였고 이종 숙주 대장균 BL21(DE3)에 도입하여 대장균 재조합 균주를 제작하였다. 다음으로 각 재조합 균주를 액체배양한 후 배양 상층액 내의 대사체들을 HPLC-ESI-MS/MS 기기분석을 통하여 분석하였다. 그 결과, 상기 유전자 세트 imrA-istC와 imrA-istC-istS를 포함하는 재조합 균주 NH4, NH5에서 각각 2-deoxy-scyllo-inosose와 2-deoxy-scyllo-inosamine의 생합성을 확인하였다. 나아가, istM과 istD를 추가적으로 조립하여 만든 NH7, NH8 및 NH9의 대사체를 분석한 결과, istM은 당전이 효소를 암호화하고 istD는 탈아세틸효소를 암호화하고 있다는 것을 알 수 있었다. 또한 istM이 istD보다 앞서 생합성 경로에 작용하여 2’-N-acetyl-IST-FU-10을 거쳐 IST-FU-10이 최종적으로 생합성 됨을 확인했다.두번째 목표를 위하여, 이전에 밝혀진 메틸전이효소를 주형으로 한 인실리코 분석을 통해 istU 유전자가 N-메틸전이효소를 암호화하고 있다고 예측하였다. 이 IstU의 기능적 역할을 특성화하기 위해 이스타마이신의 구조에 가장 근접한 유사-삼당류인 겐타마이신 C1a 및 C2를 대안적인 기질로 사용하여 in vitro 효소 반응을 진행하였고, 두 기질에서 모두 6’-N-메틸화를 발견할 수 있었다. 나아가, 좀 더 유사한 기질을 이용한 동역학적 실험을 위해서 겐타마이신 C1a 과 C2를 화학적으로 가수분해하여 유사-이당류로 만들었고 상업적으로 구매가능한 neamine을 준비하였다. 그 결과, 대조군과 비교하여 6’-N-메틸화된 새로운 생성물을 확인하였고 IstU는 6’-N-메틸전달효소를 암호화하는 유전자임을 확인하였다. 또한 이-삼당류의 아미노글리코사이드 항생제의 범위 내에서 기질 유연성을 보이지만 6’-위치에 메틸기가 없으며 3’, 4’-위치에 수산기가 없는 기질을 선호함으로서, 기질의 구조적 차이에 의해 촉매 활성 및 효율에 영향을 받음을 알 수 있었다.이스타마이신 아미노글리코사이드 항생제의 완전한 경로를 밝혀내지는 못했지만, 이상의 결과를 통하여 전반적인 생합성 경로에 대한 유전자들의 기능을 규명할 수 있었다. 특히, 이종 숙주 발현을 통한 이스타마이신 관련 생합성 경로의 규명을 처음으로 이루었고 경로의 후기 단계를 결정할 때 생합성 플랫폼의 기초가 될 수 있으며, 생산성 향상을 위한 대사 공학에 적용되어 새로운 약제 연구 개발에 기여할 것으로 기대된다.