부산대학교 도서관

In Parkinson’s disease (PD), aberrant α-synuclein (α-syn) species are linked to the dysregulation of the autophagy lysosomal pathway, leading to dopaminergic (DA) neuronal death. However, a mechanistic link between α-syn toxicity and impaired autophagic clearance is still ambiguous. Since we identified the reduction of farnesyltransferase (FTase) α and β subunits in the substantia nigra (SN) of patients with PD and α-syn preformed fibril (PFF)-treated human DA neurons, we decided to identify the SN-specific farnesylation substrates, resulting in the identification of DIRAS2. In vitro farnesylation assay (IVF) confirmed the farnesylation of DIRAS2 at cysteine 196 residue. DIRAS2 C196S was mislocalized and readily degraded as compared to mature DIRAS2. The activation of LC3 was found in the serum-starved SH-SY5Y cells overexpressing DIRAS2 wild-type (WT) but not DIRAS2 C196S. Furthermore, overexpression of DIRAS2 WT suppressed mTOR phosphorylation and upregulated the transcriptions of key autophagy-related genes, revealing that farnesylated DIRAS2 plays a crucial role in the autophagy.To ascertain whether the loss of FTase β is relevant to PD, we knocked out FTase β in the SN via an intranigral injection of AAV-GFPcre to Fntb flox/flox mice. Also, we generated conditional DAT-FTase β-KO (DF-KO) mice expressing tamoxifen-inducible CreER recombinase in DA neurons of Fntb flox/flox mice. DF-KO mice showed the degeneration of DA neurons and autophagic inhibition, as well as motor-related behavioral abnormalities. Interestingly, the spontaneous aggregation of phosphorylated α-syn (p-α-syn) was observed in the SN and CTX of DF-KO mice, suggesting that the loss of FTase β is involved in synucleinopathy. To validate the relationship between DIRAS2 farnesylation and the autophagic activation, we knocked out DIRAS2 by injecting Lenti-CRISPR-Diras2 to the SN, followed by intrastriatal α-syn PFF and intranigral Lenti-Flag-DIRAS2 WT or C196S injection. Acceleration of p-α-syn aggregation and autophagic inhibition were observed in the SN of DIRAS2 KO that were restored by the introduction of DIRAS2 WT, not C196S. In summary, we found that α-syn PFF-mediated inhibition of DIRAS2 farnesylation contributes to autophagic dysfunction and DA neuronal degeneration in PD models. These results suggest that modulation of DIRAS2 farnesylation might be a potential target for therapeutic interventions in PD and related synucleinopathies.
파킨슨병에서, α-synuclein(α-syn)의 축적과 그의 돌연변이 등은 세포 자가포식 과정에 영향을 끼쳐 결국 도파민 뉴런의 소실로 이어진다. 그러나, α-syn의 독성과 세포 자가포식의 기능 장애 간 연관 관계는 아직 정확히 알려져 있지 않다. 우리는 파킨슨병 환자의 흑질에서 farnesyltransferase(FTase)의 subunit인 FTase α와 FTase β의 단백질 발현량이 감소된 것을 발견하였다. 또한, α-syn preformed fibril(PFF)을 친 human 도파민 뉴런과, 선조체에 α-syn PFF를 주사한 마우스의 흑질에서도 FTase α와 β의 단백질 발현량이 감소된 것을 확인하였다. 또한, α-syn PFF가 FTase와 결합하며 FTase β의 전사를 억제하는 것도 확인하였다.다음으로, 파킨슨병 연관 farnesylation 기질로써 DIRAS2를 찾았다. DIRAS2는 흑질, 해마, 선조체, 대뇌 피질 등 뇌에서 많이 발현되었다. 우리는 DIRAS2가 196번째 cysteine에서 farnesylation이 되는 것을 증명하였으며 farnesylation 여부에 따라 DIRAS2의 세포 내 위치가 다르게 나타났다. 또한, FTase 억제제 FTI-277에 의해 DIRAS2의 불안정성이 증가하는 것을 확인하였다. 야생형 DIRAS2 과발현은 혈청을 제거한 배양액에서 자란 SH-SY5Y 세포에서 자가포식을 활성화시켰다. 그러나 DIRAS2 C196S 돌연변이를 과발현하거나 FTI-277을 처리하면 이러한 현상이 일어나지 않은 것을 LC3 활성화와 mTOR 인산화 레벨을 통해 확인했다.FTase β의 소실과 파킨슨병 간의 병리학적 연관성을 연구하기 위해, Fntb flox/flox 마우스 흑질에 AAV-GFPcre를 주사하여 도파민 뉴런의 소실과 DIRAS2의 farnesylation이 억제된 것을 확인하였다. 또한, 도파민 뉴런에서 tamoxifen에 의해 CreER 재조합효소를 발현하는 DAT-FTase β-KO(DF-KO) 마우스를 만들었다. DF-KO 마우스는 흑질과 선조체에서 도파민 뉴런의 소실을 보였고 자가포식 억제와 운동능력 저하, 후각 이상 등 행동 이상도 보였으며, Lenti-FTase β 주사로 이상 현상들이 회복되었다. 흥미롭게도, DF-KO 마우스의 흑질과 대뇌 피질에서 인산화된 α-syn의 자발적 응집이 발견되어 FTase β와 synucleinopathy 간 연관 가능성을 보여주었다.또한, DIRAS2 낙아웃 마우스에 α-syn PFF와 DIRAS2 (야생형 또는 C196S) 렌티바이러스를 주사하여 DIRAS2의 farnesylation이 α-syn PFF의 응집 억제와 자가포식 활성화, 도파민 뉴런의 생존에 중요한 역할을 하는 것을 확인하였다. 요컨대, α-syn PFF로 인한 FTase 파괴는 DIRAS2의 farnesylation을 억제하여 자가포식 활성화를 저하시키고 도파민 뉴런의 소실을 야기한다. 그러므로, 파킨슨병에서 FTase의 역할은 도파민 뉴런의 생존에 매우 중요하며, DIRAS2의 farnesylation은 파킨슨병 발병 기작을 조절하는 중요한 요소가 될 수 있다.