부산대학교 도서관

뇌허혈(cerebral ischemia)은 뇌혈관질환(cerebrovascular disease)의 하나인 뇌졸중(stroke)에서 가장 많이 나타나는 형태로서 뇌신경세포의 손상과 뇌기능의 소실을 유발한다. 뇌허혈로 인한 신경세포 사멸은 산소와 포도당을 결핍시키는 신경세포 손상 모델(Oxygen-Glucose Deprivation, OGD)을 사용하여 유발시킬 수 있다. 산소-포도당 결핍에 따른 세포 사멸 과정은 downstream 과정으로 glutamate에 의한 독성, 활성산소 생성, 여러가지 효소활성등을 포함한다. 특히, secondary injury 과정에 매우 중요한 요소로 작용하는 glutamate에 의한 독성은 세포내로의 칼슘 유입을 촉진시킨다. 산소-포도당 결핍으로 인해 신경말단에서 일어나는 glutamate의 과량분비는 신경세포막에 존재하는 EAA receptor를 과도하게 자극하여 신경 세포 손상에 원인으로 작용된다. 또한 과도한 자극으로 인해 세포내로 유입된 칼슘 이온에 의해 칼슘 농도 의존적으로 활성을 띄는 효소인 calpain의 활성이 일어나게된다.본 연구에서는 활성화된 calpain에 의한 신경 세포 사멸을 차단하기 위해 새로운 calpain inhibitor(KYS-4516, KYS-4500)를 합성하여 산소-포도당 결핍 모델과 glutamate 노출에 의한 세포 사멸 모델에서의 calpain inhibitor를 통한 뇌신경 세포 보호효과를 찾고자 하였다. Glutamate 노출에 의한 세포사멸 모델은 고농도(200 μM)의 glutamate와 저농도(1 μM)의 glutamate의 노출을 각각 실시하여 약물효과를 비교.분석하였다. 각각의 모델에서의 세포 손상 정도는 LDH와 MTT assay를 통해 알 수 있었고, 그에 관여하는 calpain1과 caspase3에 관한 사항은 Immunocytochemistry와 westernblot을 통해 측정하였다. 더불어, apoptosis 정도를 알기 위해 TUNEL assay를 실시하여 각 모델에서apoptotic cell을 확인하였다.우선, 일차 배양한 대뇌피질 신경세포에 산소와 포도당을 결핍시키고 재관류(reperfusion)를 하면 뇌졸중에서와 유사한 세포사멸이 유도된다. 또한 배양된 세포에 농도를 달리한 glutamate를 처리하여 산소-포도당 결핍 모델에 있어 중요한 세포사멸 기전에 관여하는 glutamate에 의한 세포사멸을 유도하였다. 연구에서 사용한 산소-포도당 결핍 모델과 고농도의 glutamate에 의한 세포 사멸 모델에서는 비가역적인 NMDA receptor 저해제를 제외한 calpain inhibitor에서는 유의성 있는 신경세포 보호효과를 찾아볼 수 없었다. 하지만, 후보물질인 KYS-4516과 이미 널리 사용되고 있는 calpain inhibitor인 MDL-28170의 경우 저농도의 glutamate에 의해 유도되는 apoptosis에 의한 세포사멸에 있어 유의성 있는 보호효과를 나타내었다. 더불어 위 모델에서 calpain inhibitor와 함께 caspase inhibitor로 사용되고 있는 z.VAD.fmk를 함께 처리하였을 때 칼페인 저해제의 효과를 극대화 할 수 있었다. 이는 caspase inhibitor가 이번 연구에서 사용한 모든 뇌졸중 모델에서 단독 사용시에 보호효과를 나타내지 못한 점으로 보아 의미있는 결과로 보여진다.연구 과정에서 사용한 각각의 뇌졸중 모델에서 Immunocytochemistry를 실시하여 각 모델에서 나타나는 calpain-1의 활성 정도를 확인한 결과 OGD 모델과 고농도의 glutamate를 사용한 모델에서는 calpain-1의 활성이 관찰되지 않았다. 반면에 저농도의 glutamate에 의해 유발되는 apoptosis 모델에서는 calpain-1의 활성이 눈에 띄게 증가하는것으로 보여졌다.Apoptosis를 일으키는 저농도의 glutamate에 의한 세포사멸 모델에서는 세포구조를 이루는 구조 단백질 중 하나인 spectrin의 분해를 측정하였으며 이러한 spectrin의 분해 정도는 MK-801뿐 아니라 calpain inhibitor를 사용하여서도 강력히 저해할 수 있는 것으로 나타났다. 더욱이 후보물질인 KYS-4516의 경우 spectrin의 calpain 분해산물로 알려진 145KDa 단위 뿐 아니라 apoptosis 인자들에 의해 분해된다고 알려진120KDa 단위의 분해산물 생성을 강력히 저해하여 상대적으로 apoptosis에 의한 세포사멸에 밀접한 관련이 있는 것으로 보여졌다.따라서, calpain inhibitor의 경우 심각한 자극에 의한 necrosis pathway보다 delayed cell death pathway인 apoptosis에 깊히 관여하고 있다고 사료되어진다. 또한 calpain에 의한 세포사멸의 경우 calpain과 상호작용하는 또 다른 세포사멸 기전을 동시에 차단시킬 때 그 효과를 극대화 할 수 있는 것으로 보이며, 이러한 calpain inhibitor의 뇌신경보호 효과는 만성적인 뇌질환에 있어 뇌신경 보호 약물로서의 가능성을 충분히 가지고 있다고 사료되어진다. 더욱이 뇌신경보호를 위한 여타의 약물과 함께 처리 할때 최대의 효과를 얻을 수 있을 것이라 판단된다.
Ischemic neuronal cell death can be simulated by oxygen and glucose deprivation (OGD) in cortical neuronal cell cultures and it may cause a number of downstream effects, including glutamate toxicity, generation of reactive oxygen species (ROS) and activation of various enzymes. Especially, glutamate toxicity, an important component of secondary injury, triggering increase in Ca2+ influx. So, OGD-induced ischemic neuronal cell damage may be linked to overstimulation of excitatory amino acid (EAA) receptors by excessive amount of glutamate released from presynaptic nerve terminals. Glutamate-induced cell death has been suggested to be associated with activation of calpains by excessive levels of intracellular calcium ions.The present study, therefore, was performed to examine neuroprotective effects of novel calpain inhibitors (KYS-4516 and KYS-4500) synthesized in our laboratory using neuronal cell death models induced by OGD or acute (200 μM) and mild (1 μM) doses of glutamate in cortical neuronal cultures prepared from Sprague-Dawley rats on embryonic days of 17~18. Cell viability was measured by MTT assay. Activated calpain I and caspase-3 were detected using immunocytochemistry and westernblot, respectively.First of all, OGD was induced by transferring 7-day cultured neuronal cells to an anaerobic chamber, rinsing with the anaerobic gas mixture (5% H2, 5% CO2, and 90% N2) and maintaining at 37℃ for 2 hr, followed by reperfusion for approximately 1 day. Cortical neuronal cells were also exposed to glutamate in the absence or presence of the novel calpain inhibitors or a known calpain inhibitor, MDL-28170. None of the calpain inhibitors showed neuroprotective effects against neuronal cell death induced by OGD and the acute high dose of glutamate. However, both KYS-4516 and MDL-28170 inhibited activation of calpain I and apoptotic cell death induced by a mild dose of glutamate with KYS-4516 being more potent. In addition, the neuroprotective effects of the calpain inhibitors were enhanced when treated in combination with a broad caspase inhibitor, z.VAD.fmk, suggesting that both calpain and caspase-3 play important roles in glutamate-induced apoptotic cell death.To confirm apoptosis, we performed TUNEL staining and examined the expression of apoptotic markers such as caspase-3 in the absence or presence of each drugs and inhibitors. In cortical neuronal cells exposed to mild dose of glutamate, 150/145 KDa and 120 KDa subunits of α-spectrin breakdown products (SBDP) significantly increased. In this cytotoxic condition, MDL-28170 and a novel calpain inhibitor, KYS-4516 suppressed degradation of α-spectrin.The results of present study suggest that a novel calpain inhibitor, KYS-4516 inhibited activation of calpain and caspase-3, respectively and also may be developed as a potential neuroprotective agent for the treatment of ischemic stroke.