학술논문
Biochemical characterization of human dopamine receptor 4 (hD4R) / 곤충 세포를 이용한 G-protein 수용체인 D4R의 생화학적 기능 연구
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Dissertation/ Thesis
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English
Abstract
Human dopamine receptor 4 (hD4R) is a member of G-protein coupled receptor (GPCR) A families, consisting of seven transmembrane domains. Since GPCRs involve in key physiological and sensory processes in humans, those are prominent drug targets. hD4R is related on neuronal and psychological condition of human such as addiction, bipolar disorder, schizophrenia and Parkinson’s disease. To study structure of membrane proteins, LCP crystallization method is a powerful tool, especially GPCR families. Many GPCR structures were solved by LCP crystallography. In this study, to solve the structure of human dopamine receptor 4 (hD4R), several methods were used. First, to express stable and high yield protein, T4 lysozyme (T4L) was fused in intracellular loop 3 (ICL3) of hD4R. Second, four antagonist ligands and N-dodecyl-D-maltose (DDM) micelle detergent were used for purification to stabilize the protein. Third, thermal stability of protein is important to make membrane protein crystal, purified hD4R were tested Tm value by fluorescent spectroscopy using the N-[4-(7-diethylamino-4-methyl-3-coumarinyl)phenyl]maleimide (CPM). Lastly, homogeneities of hD4R and ligand complex were confirmed by size exclusion chromatography (SEC). Finally, the best protein-ligand complex was chosen and done initial LCP crystal screening. Unfortunately, initial hit of protein crystal were not detected yet, but keep trying LCP screening. In addition, three-dimensional structure of hD4R would be detected by this approach it could help development of specific drugs, which are related on addiction and psychological symptoms.
GPCR(G-protein coupled receptor)은 세포막에 존재하는 가장 큰 단백질군으로, 세포 외부에서 오는 다양한 자극들을 인지하여 세포 내부로 신호를 전달하는 역할을 하는 수용체이다. GPCR은 사람을 비롯한 다양한 포유동물에서 약 800여종이 발견되었으며 크게 class A, B, C, D, E, F의 6가지로 구분된다. 또한 현재 연구개발 중인 신약의 타겟 분자들 중에 40%이상을 차지하고 있는 중요한 단백질이다. 본 연구에서 연구하고자 하는 dopamine 수용체 4는 class A에 속하는 GPCR로 주로 중추신경계에 발현되며 신경전달물질 중 하나인 dopamine과 결합하여 세포 내부로 신호를 전달하며, 사람의 다양한 신경, 정신적 상태에 관여한다. 특히 hD4R에 돌연변이가 발생하게 되면 정신분열증, 조울증, 파킨슨병, 거식증 등의 정신, 신경성 질환이 생긴다고 알려져 있다. 이 연구의 목적은 LCP crystallization을 통하여 hD4R의 3차원 구조를 규명하여 다양한 정신, 신경성 질환의 신약을 개발하는데 도움을 주기 위한 hD4R의 생화학적 기능과 특성을 연구하는데 있다. 우선 본 연구를 수행하기 위하여, 최적화 시킨 단백질의 과발현을 진행하였다. 특히 단백질의 안정화와 결정화에 중요한 역할을 하는 T4L을 D4R의 ICL3에 fusion한 chimeric한 construct를 제작하였다. hD4R의 과발현은 Spodoptera frugipreda에서 분리한 곤충 세포주인 Sf9에 감염되는 baculovirus를 이용하였다. 이렇게 곤충 세포를 이용하여 과발현한 단백질은 세포막과 비슷한 환경을 조성하여 정제를 하였으며, 정제되는 단백질의 안정화를 위하여 여러 가지 ligand를 사용하였다. 정제된 단백질에 각 ligand의 결합에 따른 안정성을 확인해 보기 위하여 thermal stability와 homogeneous를 측정하였다. Thermal stability를 측정하기 위하여 thermal 분광학을 이용하였다. Thermal 분광학은 단백질 내에 존재하는 시스테인 잔기의 노출 정도에 따라 Tm 값을 구할 수 있으며 이는 thiol에 반응하는 coumarin 화합물인 7-diethylamino-3-(4'-meleimidylphenyl)-4- methylcoumarin (CPM)의 특성을 적용한 것이다. 단백질의 thermal stability는 온도가 높아짐에 따라 변성된 단백질에서 노출된 시스테인 잔기와 CPM이 반응하여 방출하는 형광 값의 변화를 측정하여 Tm 값을 계산할 수 있으며, 측정된 Tm 값이 높을수록 단백질의 온도와 같은 외부환경으로부터 folding 상태를 더 안정적으로 유지함을 의미한다. 마찬가지로 정제된 단백질이 homogeneous한 형태를 유지하는지 UPLC를 통하여 확인할 수 있었다. 위와 같은 여러 가지 실험들을 통하여 hD4R의 LCP crystallization하는데 작용하는 중요한 요인들의 실험적인 조건을 얻을 수 있었다. 나아가 LCP crystallization이 되는 최적의 조건을 찾아 단백질 결정을 통해 hD4R의 3차원 구조를 규명하게 되면 다양한 정신, 신경성 질환의 치료를 위한 신약 개발에 큰 도움이 될 것이다.
GPCR(G-protein coupled receptor)은 세포막에 존재하는 가장 큰 단백질군으로, 세포 외부에서 오는 다양한 자극들을 인지하여 세포 내부로 신호를 전달하는 역할을 하는 수용체이다. GPCR은 사람을 비롯한 다양한 포유동물에서 약 800여종이 발견되었으며 크게 class A, B, C, D, E, F의 6가지로 구분된다. 또한 현재 연구개발 중인 신약의 타겟 분자들 중에 40%이상을 차지하고 있는 중요한 단백질이다. 본 연구에서 연구하고자 하는 dopamine 수용체 4는 class A에 속하는 GPCR로 주로 중추신경계에 발현되며 신경전달물질 중 하나인 dopamine과 결합하여 세포 내부로 신호를 전달하며, 사람의 다양한 신경, 정신적 상태에 관여한다. 특히 hD4R에 돌연변이가 발생하게 되면 정신분열증, 조울증, 파킨슨병, 거식증 등의 정신, 신경성 질환이 생긴다고 알려져 있다. 이 연구의 목적은 LCP crystallization을 통하여 hD4R의 3차원 구조를 규명하여 다양한 정신, 신경성 질환의 신약을 개발하는데 도움을 주기 위한 hD4R의 생화학적 기능과 특성을 연구하는데 있다. 우선 본 연구를 수행하기 위하여, 최적화 시킨 단백질의 과발현을 진행하였다. 특히 단백질의 안정화와 결정화에 중요한 역할을 하는 T4L을 D4R의 ICL3에 fusion한 chimeric한 construct를 제작하였다. hD4R의 과발현은 Spodoptera frugipreda에서 분리한 곤충 세포주인 Sf9에 감염되는 baculovirus를 이용하였다. 이렇게 곤충 세포를 이용하여 과발현한 단백질은 세포막과 비슷한 환경을 조성하여 정제를 하였으며, 정제되는 단백질의 안정화를 위하여 여러 가지 ligand를 사용하였다. 정제된 단백질에 각 ligand의 결합에 따른 안정성을 확인해 보기 위하여 thermal stability와 homogeneous를 측정하였다. Thermal stability를 측정하기 위하여 thermal 분광학을 이용하였다. Thermal 분광학은 단백질 내에 존재하는 시스테인 잔기의 노출 정도에 따라 Tm 값을 구할 수 있으며 이는 thiol에 반응하는 coumarin 화합물인 7-diethylamino-3-(4'-meleimidylphenyl)-4- methylcoumarin (CPM)의 특성을 적용한 것이다. 단백질의 thermal stability는 온도가 높아짐에 따라 변성된 단백질에서 노출된 시스테인 잔기와 CPM이 반응하여 방출하는 형광 값의 변화를 측정하여 Tm 값을 계산할 수 있으며, 측정된 Tm 값이 높을수록 단백질의 온도와 같은 외부환경으로부터 folding 상태를 더 안정적으로 유지함을 의미한다. 마찬가지로 정제된 단백질이 homogeneous한 형태를 유지하는지 UPLC를 통하여 확인할 수 있었다. 위와 같은 여러 가지 실험들을 통하여 hD4R의 LCP crystallization하는데 작용하는 중요한 요인들의 실험적인 조건을 얻을 수 있었다. 나아가 LCP crystallization이 되는 최적의 조건을 찾아 단백질 결정을 통해 hD4R의 3차원 구조를 규명하게 되면 다양한 정신, 신경성 질환의 치료를 위한 신약 개발에 큰 도움이 될 것이다.