학술논문
A Study On The Cell-Mediated Immune Responses With Regard To Helper And Cytotoxic T Cells In Olive Flounder (Paralichthys Olivaceus)
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Dissertation/ Thesis
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English
Abstract
척추 동물에서 적응 면역 반응에 중요한 역할을 하는 T세포는 그 기능에 따라 도움T세포와 세포독성T세포로 분류된다. 도움T세포와 세포독성T세포는 각각 CD4 및 CD8 당단백질의 발현에 의해 규정된다. 포유류에서 CD4 세포는 4개의 면역글로불린과 유사한 세포 외 도메인 (D1 – D4), 막 관통 영역 및 세포질 꼬리로 구성된다. 포유류의 CD8 세포는 알파 사슬로 구성된 동종이량체 또는 알파 사슬과 베타 사슬로 구성된 이종이량체로 나타나는 막 결합 당단백질이다. CD8알파 및 CD8베타 세포는 모두 면역글로불린과 유사한 세포 외 도메인, 막 관통 영역 및 세포질 꼬리로 구성된다. CD4 당단백질은 N 말단 도메인 (D1과 D2)을 통해 제 2 주요 조직적합성 복합체와 상호작용하고 CD8 당단백질은 면역글로불린 유사 도메인을 통해 제 1 주요 조직적합성 복합체와 상호작용함으로써 외부 항원 인식에 관여한다. T세포의 활성화를 위해, CD4 및 CD8 당단백질의 세포질 꼬리는 Lck 키나아제를 이용하여 항원 인지 신호를 세포 내로 전달한다. CD4-1 및 CD4-2와 같은 두 가지 하위 집단으로 구성된 CD4 세포는 여러 어류 종에서 조사되었다. 4개의 면역글로불린 유사 도메인, 막 관통 영역 및 세포질 꼬리를 포함하는 CD4-1 세포는 포유류의 CD4 세포와 유사하게 나타난다. 반면에 CD4-2로 불리는 두번째 CD4 세포는 2개 또는 3개의 면역글로불린 유사 도메인을 가지고 있다. 물고기의 CD4-1 및 CD4-2 분자는 세포질 영역에 p56lck 티로신 키나아제에 결합할 수 있는 중요한 모티프를 가지고 있으며, 이러한 CD4 분자는 포유류와 유사한 방식으로 Lck와 상호 작용하는 것으로 보인다. 또한 물고기의 CD4 분자는 항원과의 상호 작용 후 세포 내 신호 전달에 필수적인 세포질 모티프를 통한 도움T세포의 활성화에 관여할 수 있다.CD8 세포는 포유류뿐만 아니라 다양한 종의 어류에서 잘 밝혀져 있다. 어류의 CD8 분자는 CD8알파와 CD8베타라는 두 개의 별개의 유전자로 나뉘며 대부분 T세포 표면에서 알파사슬과 베타사슬로 구성된 이종이량체로 표현되고, 이는 포유류 CD8 분자와 유사하다. CD8 유전자의 전체적인 구조는 척추 동물 진화 전반에 걸쳐 잘 유지되어 왔으며, 주요 영역은 포유류와 어류에서 유사하게 구분된다. 그러나 p56lck 결합 부위로 알려진 C-X-C 모티프는 포유류의 CD8알파 세포질 꼬리에서만 찾을 수 있는 반면, C-X-C 모티프 대신 C-X-H 모티프는 어류에서 CD8알파 및 CD8베타 서열 모두에 존재한다. 어류에서의 CD4 및 CD8 유전자의 발현이 포유류에서와 유사하게 나타나지만, CD4 및 CD8 세포를 탐지하기 위한 단일클론항체가 부족해 어류에서의 CD4 및 CD8 세포의 기능을 밝히는 데는 한계가 있다. CD4 와 CD8 림프구를 특이적으로 탐지할 수 있는 단일클론항체가 넙치를 포함한 여러 종의 어류에 존재하지만 CD4 및 CD8 림프구와 관련된 세부적인 기능적 활동에 대한 연구는 여전히 부족하다.본 연구에서는 넙치의 CD4 T세포에 속하는 CD4-1, CD4-2 림프구와 CD8 T세포에 속하는 CD8 림프구를 특이적으로 탐지하는 단클론항체를 개발하였다. 네 종류의 단클론항체는 효소 면역 분석법, 웨스턴 블롯 분석, 면역형광염색, 유세포 분석 및 역전사효소중합효소연쇄반응을 통해 항원으로 작용한 각각의 단백질에 특이적으로 반응하는 것으로 밝혀졌다. 이 항체들을 이용하여 바이러스, T세포 자극 항원, B세포 자극 항원을 생체 내 감염 후 실제 넙치의 세포 매개 면역 반응에 중요한 역할을 하는 CD4 및 CD8 T 림프구의 증감을 조사하였다. 또한 여러 종류의 사이토카인 및 전사 인자의 발현을 관찰함으로써 세포 매개 면역 반응에서 도움T세포와 세포독성T세포의 역할을 검증하였다. Chapter 1 : 포유류에서 4개의 면역글로불린 유사 세포 외 도메인을 가진 한 종류의 CD4 T세포가 존재하는 것과 달리 어류에서는 포유류의 CD4 T세포와 유사한 CD4-1 T세포와 2개 혹은 3개의 면역글로불린 유사 세포 외 도메인을 가진 CD4-2 T세포가 존재한다. 본 연구에서는 넙치의 CD4-1과 CD4-2 유전자를 중합효소 반응을 통하여 증폭시키고 박테리아 및 진핵 생물 발현 시스템을 통해 재조합 단백질을 생산하였다. 재조합 단백질을 항원으로 하여 CD4-1과 CD4-2 단백질을 탐지하는 작용하는 단클론항체를 생산하였다. 면역 형광 염색을 통하여 본 연구에서 개발된 두 종류의 단클론항체는 각각 CD4-1 림프구와 CD4-2 림프구를 특이적으로 탐지하며 특히 단클론항체의 결합 부위가 림프구의 세포 표면에 존재한다는 것을 확인하였다. 또한 단클론항체 양성 림프구의 유전자 전사체가 역전사효소중합효소연쇄반응을 통해 B세포 전사체가 아닌 T세포 전사체를 발현하는 프라이머에 의해서만 증폭되는 것으로 미루어 보아 단클론항체의 특이성이 T세포에 특이적이다는 것을 알 수 있었다. 두 종류의 CD4 T세포의 림프성 기관과 비림프성 기관에서의 분포도를 유세포 분석을 통하여 조사해본 결과 상대적으로 높은 수치의 CD4-1 T세포와 CD4-2 T세포 비율이 림프성 기관인 신장과 비장에서 나타났다. 본 연구에서 규명된 CD4 T세포 특이적 단클론항체를 통해 넙치의 CD4 T세포가 세포 형태학적 측면, 조직별 분포도 및 유전자 발현 면에서 포유류의 CD4 T세포와 유사하다는 것을 검증하였다.Chapter 2 : CD8 림프구를 특이적으로 탐지할 수 있는 단일클론항체가 넙치를 포함한 여러 종의 어류에 존재하지만 CD8 림프구와 관련된 세부적인 기능적 활동에 대한 연구는 여전히 부족하다. 본 연구에서는 CD8 T세포에 속하는 CD8알파와 CD8베타 세포의 유전자 서열 중 2차 구조, 항원성, 친수성 및 소수성을 고려하여 펩타이드를 합성하였다. 합성된 펩타이드를 이용하여 CD8알파 및 CD8베타 세포를 탐지하는 단클론항체를 마우스 면역을 통해 생산하였다. 생산된 단클론항체가 각각의 CD8 유전자 전체를 클로닝한 재조합 단백질에도 특이적으로 반응할 수 있음을 효소 면역 분석법, 웨스턴 블롯 분석 및 형광 염색을 통하여 증명하였다. 본 연구에서 개발된 두 종류의 단클론항체는 면역 형광 염색을 통하여 각각 CD8알파 림프구와 CD8베타 림프구, 특히 림프구의 세포 표면을 탐지한다는 것을 알 수 있었다. 또한 CD8알파 및 CD8베타 단클론항체의 반응성이 T세포에 특이적이다는 것을 역전사효소중합효소연쇄반응을 통해 확인되었다. 두 종류의 CD8 특이적 단클론항체를 이용한 유세포 분석을 통하여 CD8 T세포의 조직별 분포도를 조사해본 결과 상대적으로 높은 수치의 CD8 T세포 비율이 신장과 비장뿐만 아니라 아가미와 장에서도 나타났다. 본 연구에서 검증된 CD8알파 및 CD8베타 T세포를 특이적으로 탐지하는 단클론항체를 통해 넙치의 CD8 T세포가 세포 형태학적 측면, 조직별 분포도 및 유전자 발현 면에서 포유류의 CD8 T세포와 유사하다는 것을 확인하였다.Chapter 3 : 넙치는 우리나라에서 경제적으로 중요한 양식 종으로 어류의 면역 체계 연구를 위한 모형 어종으로 사용된다. 본 연구에서는 넙치의 주요한 바이러스성 질병 중의 하나인 신경괴사증바이러스 (Nervous necrosis virus, NNV)와 T세포 자극 항원인 Keyhole limpet hemocyanin (KLH) 및 Lipopolysaccharide (LPS)를 감염시키고 시간이 지남에 따라 CD4 T세포와 CD8 T세포의 증감을 유세포 분석을 통해 확인해 보았다. NNV 및 KLH 감염 후 CD4 및 CD8 양성 세포는 PBS를 접종한 대조군에 비해 상당히 증가한 반면, LPS 감염 그룹에서는 일정한 수준을 유지하였다. 비장, 신장 및 말초 혈액에서 CD8 양성 세포의 증가는 CD4 양성 세포의 증가보다 더 일찍 나타났다. 또한 감염 1일과 3일 후 사이토카인과 전사 인자의 발현을 실시간 중합효소연쇄반응을 통해 관찰한 결과 NNV 및 KLH 처리 후 Th1 관련 유전자는 Th2 관련 유전자보다 더 빠르고 많이 증가하였다. 이러한 결과는 CD4-1 림프구보다 CD4-2 림프구가 CD8 림프구와 협력하여 Th1 면역 반응에서 더 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다. 본 연구에서 개발된 단클론항체는 어류의 도움T세포 및 세포독성T세포의 기능에 대해 이해하고 지식을 확장하는데 유용한 도구로서 활용되어 후속연구에 이바지할 수 있을 것으로 판단된다.