학술논문
동충하초균으로 발효한 인삼잎에서 분리한 다당의 선천 면역계 자극 활성 및 구조적 특성 / Innate immune system activation and structural characteristics of polysaccharides isolated from ginseng leaf fermented by Cordyceps sinensis
Document Type
Dissertation/ Thesis
Source
Subject
Language
Korean
Abstract
In order to develop the new physiologically bioactive polysaccharides from ginseng leaf, the leaf was fermented by Cordyceps sinensis, and a crude polysaccharide isolated from its culture supernatants. For comparison of biological activity, two different polysaccharide fractions were prepared from hot water extracts (GLW, 2.48%) of ginseng leaf without fermentation and the cultures of ginseng leaf fermented by Cordyceps sinensis (GLF, 6.08%). A yield of GLF was about 2.5 times higher than that of GLW. GLW mainly consisted of galacturonic acid (49.9%), galactose (19.4%) and arabinose (16.3%). On the other hand, GLF mainly consisted of galacturonic acid (32.5%), glucose (28.0%), galactose (15.8%) and arabinose (11.9%). Methylation analysis indicated that GLF comprised at least 18 different glycosyl linkages including 4-linked Glcp residue (24.0%), being characteristics of α/β-glucan. GLW and GLF all showed high anti-complementary activity in a dose-dependent manner similar to PSK as positive control, and the activity of GLF was higher than that of GLW. In an in vitro cytotoxicity analysis, GLW and GLF did not affect the growth of peritoneal macrophages, RAW 264.7, Colon26-M3.1 carcinoma and B16BL6 melanoma cells. Peritoneal macrophages stimulated with GLW and GLF induced enhanced production of various cytokines such as IL-6, IL-12 and TNF-α. However, GLF was superior to GLW on production of cytokines. In an assay for natural killer (NK) cell activity, intravenous (i.v.) administration of GLW and GLF significantly augmented cytolytic activity on NK cell against Yac1 tumor cells. But NK cells obtained from the GLF-treated group showed higher tumorcidal activity. In experimental lung metastasis of Colon26-M3.1 carcinoma cell, prophylactically i.v. administration of GLF potently inhibited 87.7% of lung metastasis at dose of 100 μg/mouse. Furthermore, the depletion of NK cells by injection of rabbit anti-asialo GM1 partially abolished the inhibitory effect of GLF on lung metastasis. Also, i.v. administration of GLF signicicantly augmented cytotoxic T lymphocyte (CTL) cytotoxicity against Colon26-M3.1 carcinoma cell. These data suggest that anti-metastatic effect of GLF is associated with the activation of NK cells and CTL. On the other hand, prophylactically oral administration of GLF at the dose 1,000 μg/mouse for 14 days before tumor inoculation induced more than 74.5% of inhibitory effect against lung metastasis. To characterize active moiety of GLF, it was further fractionated by DEAE-Sepharose FF (Cl- form) anion exchange chromatography to give two fractions, neutral polysaccharide fraction (GLF1) and acid polysaccharide fraction (GLF2). GLF1 mainly consisted of neutral sugar (96.0%) such as glucose (73.2%), galactose (12.7%) and arabinose (10.4%). Peritoneal macrophages stimulated with GLF1 showed enhanced production of cytokines such as IL-6, IL-12 and TNF-α in a dose dependent manners. To characterize the structural features of glucan-rich polysaccharide (GLF1), GLF1 was digested by three-different linkage-specific glycosylases such as Lyticase (β-1,3-glucanase), β-1,4-glucanase and α-glucoamylase. These results indicated that GLF1 was assumed to be an α-glucan type polysaccharide. To determine the fine structure of GLF1, the four subfractions (PHI, PHIA1~PHAI3) obtained after sequential enzymatic digestion such as isoamylase and α-amylase were examined their chemical properties and biological activity. PHI obtained after isoamylase treatment of GLF1 mainly consisted of 72.8 % of glucose and it showed increased iodine reaction, resulting in a yellow-brown color. And then PHI were further treated with α-amylase and fractionated to give three different fractions (PHIA1, 2 and 3) by gel filtration. PHIA1 and PHIA2 mainly comprised of galactose and arabinose, whereas PHIA3 was compose of 96.0 % of glucose. PHIA1~3 fractions after α-amylase treatment of PHI did not show any color reaction with I2-KI solution. The results of MALDI-TOF analysis of PHIA3 indicated that PHIA3 was randomly hydrolyzed by α-glucanase. In addition, serial enzymatic digestions on GLF-I entirely removed the cytokine-production activity. These results suggest that immuno-stimulating activity of GLF1 may be due to α-glucan, which was extracellularly produced by Cordyceps sinensis during cultivation and α-glucan is a structure, α-(1→4)-glucan branched with glucan moiety at C(Ο)6 position. To elucidate structural features of another polysaccharides, GLF2 isolated from the fermented ginseng leaf. GLF2 was further purified using size exclusion chromatography on Sephadex G-75 and obtained three purified polysaccharide fractions, GLF2-I, GLF2-II and GLF2-III with different molecular weights. GLF2-I and GLF2-II mainly consisted of galactose, arabinose, rhamnose and galacturonic acid, whereas GLF2-III mainly consisted of galacturonic acid. Peritoneal macrophages stimulated with the purified polysaccharides produced various cytokines such as IL-6, TNF-α and IL-12, but GLF2-I showed highest cytokine production. Methylation analysis indicated that GLF2-I comprised 20 different glycosyl linkages including terminal-Araf, 2,4-branched Rhap, terminal-Araf, 5-linked Araf, terminal-Galp, 3-linked Galp, 4-linked Galp, 6-linked Galp and 3,6-branched Galp, being characteristics in rhamnogalacturonan I (RG-I). Only GLF2-I strongly reacted with β-glucosyl Yariv reagent (15.0%), suggesting the presence of an arabino-β-3,6-galactan moiety. These results indicated that GLF2-I was the RG-I type polysaccharide consisted of a main chain of rhamnogalacturonan and three group of side chains such as α-(1→5)-arabinan, β-(1→4)-galactan and type II arabino-β-3,6-galactan chains. Immuno-stimulating function and intracellular signaling pathway for macrophage activation of GLF2-I were also elucidated using RAW 264.7 mouse macrophage cells. GLF2-I enhanced the production of cytokines such as IL-6, TNF-α and NO production by RAW 264.7 cell lines. Also, GLF2-I augmented the mRNA expression of IL-6, TNF-α and iNOS in a dose-dependent manner. On the other hands, GLF2-I strongly induced the phosphorylation of MAPKs (JNK, ERK, p38) and NF-κB pathways in RAW 264.7 cells. In the specific inhibitor experiments, the effect of GLF2-I on IL-6, TNF-α and NO production was found to be largely suppressed by specific inhibitors of JNK (SP), and IκBα (BAY), but not ERK (PD) and p38 (SB) inhibitors. In the anti-PRRs (pattern recognition receptors) experiments, the effect of GLF2-I on IL-6, TNF-α and NO production was indicated to be suppressed by treatment of TLR2, TLR4, Dectin-1, CD14 and SR. Thus, these results suggest that GLF2-I-induced IL-6 production is primarily regulated via JNK and NF-κB pathways through TLR2 receptor and TNF-α production is regulated via JNK and NF-κB pathways through TLR2 and CD14 receptors, whereas NO production is primarily regulated via JNK and NF-κB pathways through Dectin-1, TLR4, CD14 and SR receptors. Above results suggest that a crude polysaccharide fraction (GLF) isolated from ginseng leaf fermented by Cordyceps sinensis can augment the function of innate and adaptive immune systems, and represents inhibitory effect on tumor metastasis, and RG-I from ginseng leaf and α-glucan from Cordyceps sinensis play a crucial role in expression of biological activities of ginseng leaf fermented by Cordyceps sinensis.
본 연구에서는 동충하초균으로 발효한 인삼잎으로부터 새로운 생리 기능성 식품소재를 개발하기 위해, 동 배양액으로부터 조다당을 분리/정제하고 이들의 면역활성, 구조분석 및 세포 내 신호전달 경로를 규명하고자 하였다. 인삼잎 유래 다당의 활성 비교를 위해, 인삼잎의 단순 열수추출물 유래 조다당 GLW(건물 기준 2.48%)와 동충하초균 발효 인삼잎 유래 조다당 GLF(건물 기준 6.08%)를 얻었으며, GLF가 GLW보다 2.5배 높은 수율로 회수되었다. 일반 화학적 특성을 진행한 결과, GLW의 경우, 49.9%의 galacturonic acid, 19.4%의 galactose 및 16.3%의 arabinose로 이루어진 반면, GLF의 경우, 32.5%의 galacturonic acid, 28.0%의 glucose, 15.8%의 galactose 및 11.9%의 arabinose로 구성되어 있었다. 특히, 발효 인삼잎 유래 GLF에서 더 높은 glucose 함량을 보였다. Methylation analysis를 행한 결과, GLF는 18종류의 서로 다른 결합양식으로 이루어져 있었으며, 특히, 4-linked glcp가 24.0%으로 다량 존재하는 것으로 보아 α-1,4 또는 β-1,4 결합으로 연결된 또 다른 glucan이 다량 존재할 것이라 사료되었다. GLW 및 GLF의 보체계 활성을 확인한 결과, GLW 및 GLF 모두 농도 의존적으로 양성대조군인 PSK와 유사한 높은 활성을 나타내는 것으로 확인되었으며, GLF에서 더 우수한 활성을 보였다. 이후, GLW 및 GLF 세포에 대한 직접적인 독성 여부를 확인한 결과, 정상세포 및 암세포에 대해 모두 세포 독성은 나타나지 않았다. GLW 및 GLF 시료의 macrophage 자극에 따른 cytokine 분비능을 측정한 결과, IL-6, IL-12 및 TNF-α 모두 농도 의존적으로 증가되었음을 확인하였으며, 동일 농도에서 GLF가 GLW보다 더 높은 활성을 나타냈다. NK 세포 활성능을 측정한 결과, GLW는 1,000 μg/mouse 농도에서 NC 대비 약 2배 정도 활성이 증가된 반면, GLF는 동일 농도에서 약 4배 NK 세포 활성이 증가된 것으로 확인되었다. 따라서 수율 및 면역활성이 더 우수한 GLF를 선택하여 이후 실험을 진행하였다. GLF를 정맥주사하여 항전이 활성을 확인한 결과, 100 μg/mouse 농도의 GLF 투여군에서 87.7%의 우수한 항전이 활성을 나타내었다. GLF의 항전이 활성이 NK에 의한 것인지를 확인하기 위해 anti-asialo GM1으로 NK cell의 기능을 저해시킨 후 활성을 확인한 결과, anti-asialo GM1 control보다는 colony 수가 감소한 것으로 확인되어 NK cell뿐만 아니라 다른 면역세포도 항전이 효과에 관여함을 확인하였다. 또한, CTL의 활성을 측정한 결과, 농도 의존적으로 활성이 증가되는 것으로 확인되어 GLF의 항전이 활성에는 NK cell 뿐만 아니라 CTL도 기여함을 확인하였다. 한편, GLF를 2주간 경구투여한 후 NK 세포 활성을 확인한 결과, NC 대비 100 μg/mouse 농도로 투여한 군에서 유의적으로 활성이 증가하였으며, 항전이 활성을 확인한 결과, GLF는 1,000 μg/mouse 투여한 군에서 약 74.5%의 높은 항전이 활성을 나타내는 것으로 확인되어 경구투여에서도 유효한 활성이 발현됨을 알 수 있었다. GLF의 구조분석 및 활성부위를 파악하기 위하여 anion exchange chromatography를 통해 중성다당체 GLF1과 산성다당체 GLF2를 분리하였다. GLF1은 주로 glucose (73.2 %), galactose (12.7 %), arabinose (10.4 %)로 구성되어 있었으며, cytokine 분비능을 분석한 결과, 조다당 GLF와 유사한 높은 활성을 나타내었다. 이후 중성다당체 GLF1 획분을 Lyticase (β-1,3-glucanase), β-glucosidase 및 α-glucoamylase 효소를 각각 처리한 결과, GLF1은 α-glucoamylase 처리에 의해 높은 분해율을 보임으로써, 주로 α-glucan의 형태로 존재함을 추정할 수 있었다. α-Glucan으로 확인된 GLF1의 세부구조를 확인하기 위해, isoamylase 및 α-amylase를 이용하여 연속 효소 처리 후, 단편획분에 대한 제반 화학특성과 생물활성을 조사하였다. GLF1을 isoamylase 처리한 후 얻어진 PHI 획분은 72.8%의 glucose로 구성되어 있었으며, 요오드 반응에서 황갈색 반응이 증진되는 특성을 보였다. PHI 획분은 α-amylase를 이용, 재차 효소처리하고 겔여과를 통해 PHIA1, -2 및 -3의 3개 획분으로 분획하였다. 이중 PHIA1과 PHIA2는 주로 galactose와 arabinose로 구성되어 있었으며, 저분자의 PHIA3는 96.0%의 glucose로 구성되어 있었다. 그러나 PHI 획분의 α-amylase 처리 후 얻어진 PHIA1, 2 및 3 획분은 요오드 전분 반응 검사에서 어떠한 색소 반응도 나타나지 않았다. 또한, PHIA3에 대한 MALDI-TOF 결과에서 endo type α-amylase 효소에 의해 glucose가 3~16개까지 무작위로 가수분해되었음을 확인하였다. 부가하여 이들 3개 획분은 모두 macrophage에 의한 cytokine 생산능이 완전히 사라진 결과를 보였다. 이상의 결과로부터 GLF1의 면역증진 활성은 α-glucan에 기인하며, 이는 α-(1→4)-glucan 주쇄에 C6 위치에서 다시 glucan이 측쇄로 연결된 구조임을 추정할 수 있었으며 이들이 면역 활성에 일부 공헌함을 확인하였다. Anion exchange chromatography로부터 분리된 산성다당체 GLF2 획분의 정확한 구조를 규명하고자 Sephadex G-75 컬럼을 이용하여 분자량이 상이한 세 가지 획분 GLF2-I, GLF2-II 및 GLF2-III로 정제하였다. GLF2-I 및 GLF2-II는 주로 rhamnose, galacturonic acid, galactose 및 arabinose로 구성된 반면 GLF2-III은 주로 galacturonic acid로 구성되어 있었다. 정제획분에 대한 cytokine 분비능을 측정한 결과, GLF2-I은 GLF2와 유사한 높은 활성을 보였으나, GLF2-II과 GLF2-III 부분은 낮은 활성을 나타내었다. GLF2-I 당쇄결합양식을 methylation analysis로 분석한 결과, 20개의 서로 다른 당쇄 결합이 확인되었으며 주로 terminal-Rhap, 2,4-branched Rhap, terminal-Araf, 5-linked Araf, 3-Galp, 4-Galp, 6-linked Galp 및 3,6-branched Galp가 검출되었다. 또한, Yariv reagent와의 반응성 결과에서도, GLF2-I 획분은 약 15%의 적색 침전환이 관찰되어 arabino-β-3,6-galatan이 일부 포함하는 것으로 확인되었다. 따라서 GLF2-I 다당은 arabino-β-3,6-galactan, arabinan과 galactan을 side chain으로 가지는 RG-I의 구조임을 확인하였다. 산성다당체 GLF2의 활성본체인 GLF2-I에 대한 대식세포 내 신호전달 경로를 규명하기 위해서 RAW 264.7 cell을 이용하여 IL-6, TNF-α 및 NO를 측정한 결과, 모두 농도 의존적으로 cytokine 생산능을 증가시켰다. 또한, GLF2-I은 IL-6, TNF-α 및 iNOS 유전자의 mRNA 발현량을 모두 농도 의존적으로 증가시켰다. 또한, Western blotting 실험결과, GLF2-I은 MAPK 및 NF-κB pathway를 활성화시켰다. 해당 신호전달 단백질에 특이적 저해제를 처리하고 inhibitor를 처리한 후 cytokine 생산량을 확인한 결과, IL-6, TNF-α 및 NO는 주로 JNK과 NF-κB pathway에 영향을 받는 것으로 확인되었다. 패턴 인식 수용체에 대한 중화항체를 이용한 실험에서 IL-6의 경우, 주로 TLR2를, TNF-α의 경우에는 주로 TLR2와 CD14를, NO의 경우 주로 Dectin-1, TLR4, CD14 및 SR에 결합하여 활성을 유도하는 것으로 확인되었다. 위 결과를 종합해보면 GLF2-I는 대식세포 표면에 존재하는 TLR2를 경유하여 JNK 및 NF-κB pathway를 활성화하여 IL-6를 생산하며, TNF-α의 경우, TLR2와 CD14 receptor를 경유하여 JNK pathway를 활성화하여 생산함을 확인 가능하였다. 마지막으로 NO의 경우, Dectin-1, TLR4, CD14 및 SR 수용체를 경유하여 JNK 및 NF-κB pathway를 활성화한다고 최종 결론지었다. 결론적으로 동충하초균으로 발효한 인삼잎 유래 다당 GLF는 선천면역과 적응면역계의 기능을 활성화시켜, 이를 통해 항전이 활성을 나타내며, 인삼잎 유래 RG-I 성분과 동충하초균 유래 α-glucan 성분이 발효 인삼잎의 생물활성 발현에 매우 중요한 역할을 수행함을 최종 확인하였다.
본 연구에서는 동충하초균으로 발효한 인삼잎으로부터 새로운 생리 기능성 식품소재를 개발하기 위해, 동 배양액으로부터 조다당을 분리/정제하고 이들의 면역활성, 구조분석 및 세포 내 신호전달 경로를 규명하고자 하였다. 인삼잎 유래 다당의 활성 비교를 위해, 인삼잎의 단순 열수추출물 유래 조다당 GLW(건물 기준 2.48%)와 동충하초균 발효 인삼잎 유래 조다당 GLF(건물 기준 6.08%)를 얻었으며, GLF가 GLW보다 2.5배 높은 수율로 회수되었다. 일반 화학적 특성을 진행한 결과, GLW의 경우, 49.9%의 galacturonic acid, 19.4%의 galactose 및 16.3%의 arabinose로 이루어진 반면, GLF의 경우, 32.5%의 galacturonic acid, 28.0%의 glucose, 15.8%의 galactose 및 11.9%의 arabinose로 구성되어 있었다. 특히, 발효 인삼잎 유래 GLF에서 더 높은 glucose 함량을 보였다. Methylation analysis를 행한 결과, GLF는 18종류의 서로 다른 결합양식으로 이루어져 있었으며, 특히, 4-linked glcp가 24.0%으로 다량 존재하는 것으로 보아 α-1,4 또는 β-1,4 결합으로 연결된 또 다른 glucan이 다량 존재할 것이라 사료되었다. GLW 및 GLF의 보체계 활성을 확인한 결과, GLW 및 GLF 모두 농도 의존적으로 양성대조군인 PSK와 유사한 높은 활성을 나타내는 것으로 확인되었으며, GLF에서 더 우수한 활성을 보였다. 이후, GLW 및 GLF 세포에 대한 직접적인 독성 여부를 확인한 결과, 정상세포 및 암세포에 대해 모두 세포 독성은 나타나지 않았다. GLW 및 GLF 시료의 macrophage 자극에 따른 cytokine 분비능을 측정한 결과, IL-6, IL-12 및 TNF-α 모두 농도 의존적으로 증가되었음을 확인하였으며, 동일 농도에서 GLF가 GLW보다 더 높은 활성을 나타냈다. NK 세포 활성능을 측정한 결과, GLW는 1,000 μg/mouse 농도에서 NC 대비 약 2배 정도 활성이 증가된 반면, GLF는 동일 농도에서 약 4배 NK 세포 활성이 증가된 것으로 확인되었다. 따라서 수율 및 면역활성이 더 우수한 GLF를 선택하여 이후 실험을 진행하였다. GLF를 정맥주사하여 항전이 활성을 확인한 결과, 100 μg/mouse 농도의 GLF 투여군에서 87.7%의 우수한 항전이 활성을 나타내었다. GLF의 항전이 활성이 NK에 의한 것인지를 확인하기 위해 anti-asialo GM1으로 NK cell의 기능을 저해시킨 후 활성을 확인한 결과, anti-asialo GM1 control보다는 colony 수가 감소한 것으로 확인되어 NK cell뿐만 아니라 다른 면역세포도 항전이 효과에 관여함을 확인하였다. 또한, CTL의 활성을 측정한 결과, 농도 의존적으로 활성이 증가되는 것으로 확인되어 GLF의 항전이 활성에는 NK cell 뿐만 아니라 CTL도 기여함을 확인하였다. 한편, GLF를 2주간 경구투여한 후 NK 세포 활성을 확인한 결과, NC 대비 100 μg/mouse 농도로 투여한 군에서 유의적으로 활성이 증가하였으며, 항전이 활성을 확인한 결과, GLF는 1,000 μg/mouse 투여한 군에서 약 74.5%의 높은 항전이 활성을 나타내는 것으로 확인되어 경구투여에서도 유효한 활성이 발현됨을 알 수 있었다. GLF의 구조분석 및 활성부위를 파악하기 위하여 anion exchange chromatography를 통해 중성다당체 GLF1과 산성다당체 GLF2를 분리하였다. GLF1은 주로 glucose (73.2 %), galactose (12.7 %), arabinose (10.4 %)로 구성되어 있었으며, cytokine 분비능을 분석한 결과, 조다당 GLF와 유사한 높은 활성을 나타내었다. 이후 중성다당체 GLF1 획분을 Lyticase (β-1,3-glucanase), β-glucosidase 및 α-glucoamylase 효소를 각각 처리한 결과, GLF1은 α-glucoamylase 처리에 의해 높은 분해율을 보임으로써, 주로 α-glucan의 형태로 존재함을 추정할 수 있었다. α-Glucan으로 확인된 GLF1의 세부구조를 확인하기 위해, isoamylase 및 α-amylase를 이용하여 연속 효소 처리 후, 단편획분에 대한 제반 화학특성과 생물활성을 조사하였다. GLF1을 isoamylase 처리한 후 얻어진 PHI 획분은 72.8%의 glucose로 구성되어 있었으며, 요오드 반응에서 황갈색 반응이 증진되는 특성을 보였다. PHI 획분은 α-amylase를 이용, 재차 효소처리하고 겔여과를 통해 PHIA1, -2 및 -3의 3개 획분으로 분획하였다. 이중 PHIA1과 PHIA2는 주로 galactose와 arabinose로 구성되어 있었으며, 저분자의 PHIA3는 96.0%의 glucose로 구성되어 있었다. 그러나 PHI 획분의 α-amylase 처리 후 얻어진 PHIA1, 2 및 3 획분은 요오드 전분 반응 검사에서 어떠한 색소 반응도 나타나지 않았다. 또한, PHIA3에 대한 MALDI-TOF 결과에서 endo type α-amylase 효소에 의해 glucose가 3~16개까지 무작위로 가수분해되었음을 확인하였다. 부가하여 이들 3개 획분은 모두 macrophage에 의한 cytokine 생산능이 완전히 사라진 결과를 보였다. 이상의 결과로부터 GLF1의 면역증진 활성은 α-glucan에 기인하며, 이는 α-(1→4)-glucan 주쇄에 C6 위치에서 다시 glucan이 측쇄로 연결된 구조임을 추정할 수 있었으며 이들이 면역 활성에 일부 공헌함을 확인하였다. Anion exchange chromatography로부터 분리된 산성다당체 GLF2 획분의 정확한 구조를 규명하고자 Sephadex G-75 컬럼을 이용하여 분자량이 상이한 세 가지 획분 GLF2-I, GLF2-II 및 GLF2-III로 정제하였다. GLF2-I 및 GLF2-II는 주로 rhamnose, galacturonic acid, galactose 및 arabinose로 구성된 반면 GLF2-III은 주로 galacturonic acid로 구성되어 있었다. 정제획분에 대한 cytokine 분비능을 측정한 결과, GLF2-I은 GLF2와 유사한 높은 활성을 보였으나, GLF2-II과 GLF2-III 부분은 낮은 활성을 나타내었다. GLF2-I 당쇄결합양식을 methylation analysis로 분석한 결과, 20개의 서로 다른 당쇄 결합이 확인되었으며 주로 terminal-Rhap, 2,4-branched Rhap, terminal-Araf, 5-linked Araf, 3-Galp, 4-Galp, 6-linked Galp 및 3,6-branched Galp가 검출되었다. 또한, Yariv reagent와의 반응성 결과에서도, GLF2-I 획분은 약 15%의 적색 침전환이 관찰되어 arabino-β-3,6-galatan이 일부 포함하는 것으로 확인되었다. 따라서 GLF2-I 다당은 arabino-β-3,6-galactan, arabinan과 galactan을 side chain으로 가지는 RG-I의 구조임을 확인하였다. 산성다당체 GLF2의 활성본체인 GLF2-I에 대한 대식세포 내 신호전달 경로를 규명하기 위해서 RAW 264.7 cell을 이용하여 IL-6, TNF-α 및 NO를 측정한 결과, 모두 농도 의존적으로 cytokine 생산능을 증가시켰다. 또한, GLF2-I은 IL-6, TNF-α 및 iNOS 유전자의 mRNA 발현량을 모두 농도 의존적으로 증가시켰다. 또한, Western blotting 실험결과, GLF2-I은 MAPK 및 NF-κB pathway를 활성화시켰다. 해당 신호전달 단백질에 특이적 저해제를 처리하고 inhibitor를 처리한 후 cytokine 생산량을 확인한 결과, IL-6, TNF-α 및 NO는 주로 JNK과 NF-κB pathway에 영향을 받는 것으로 확인되었다. 패턴 인식 수용체에 대한 중화항체를 이용한 실험에서 IL-6의 경우, 주로 TLR2를, TNF-α의 경우에는 주로 TLR2와 CD14를, NO의 경우 주로 Dectin-1, TLR4, CD14 및 SR에 결합하여 활성을 유도하는 것으로 확인되었다. 위 결과를 종합해보면 GLF2-I는 대식세포 표면에 존재하는 TLR2를 경유하여 JNK 및 NF-κB pathway를 활성화하여 IL-6를 생산하며, TNF-α의 경우, TLR2와 CD14 receptor를 경유하여 JNK pathway를 활성화하여 생산함을 확인 가능하였다. 마지막으로 NO의 경우, Dectin-1, TLR4, CD14 및 SR 수용체를 경유하여 JNK 및 NF-κB pathway를 활성화한다고 최종 결론지었다. 결론적으로 동충하초균으로 발효한 인삼잎 유래 다당 GLF는 선천면역과 적응면역계의 기능을 활성화시켜, 이를 통해 항전이 활성을 나타내며, 인삼잎 유래 RG-I 성분과 동충하초균 유래 α-glucan 성분이 발효 인삼잎의 생물활성 발현에 매우 중요한 역할을 수행함을 최종 확인하였다.