부산대학교 도서관

AbstractExpression and Function of Programmed Death-1 on Macrophages and B Cells from the Lipopolysaccharide-induced Animal Sepsis Model Eun-Kyoung Choi(Microbiology)(Advisor: Prof, Soo-Woong Lee)Department of MedicineGraduate School, Inje University Objectives PD-1 is one of the important immune-inhibitory molecules which were expressed in T, B, NKT and macrophages activated by various immune activating factors. Recent study reported that PD-1 KO mice shows a great innate immune response and survival rates to Listeria infection, expecting it an important factor in sepsis. Lipopolysaccaride (LPS), the major component of the outer membrane of gram-negative bacteria, is one of the crucial immunogens for PD-1 expression. However, there are a few reports on the expression mechanisms and the functions of PD-1 in innate immune cells. In this study, we investigate the expression mechanisms and the functions of PD-1 using various immune cells from the spleen and peritoneal macrophages of the LPS-induced mouse sepsis model, as well as LPS-stimulated RAW 264.7 cell line and splenic B cells. Methods The expression of PD-1 was analyzed in immune cells isolated from spleen of LPS-injected C57BL/6 mice using flow cytometry. Mouse peritoneal macrophages, RAW264.7 cell line and splenic B cells were treated with LPS and PD-1 expression was then confirmed by RT-PCR or Western Blot. PD-1 promoter was also investigated using reporter gene assay and various signal transduction inhibitors. We studied the important transcription factors for PD-1 expression using ChIP assay and co-immunoprecipitation. Function of PD-1 was analyzed in mouse macrophages and B cells using recombinant mouse B7-H1-Fc (rmB7-H1) known as PD-1 ligand. Results PD-1 was expressed on CD4 T cells, B cells and macrophages isolated from spleen of LPS-induced mouse sepsis model. B cells were showed high level of PD-1 expression. PD-1 expression was also up-regulated in mouse macrophages and B cells in response to LPS in vitro. In promoter assay, NF-kB and IRF-1 binding regions in mouse PD-1 promoter are important for PD-1 expression. We also found that the co-activation of NF-kB and IRF-1 is necessary for the maximum PD-1 expression. PD-1 engagement with rmB7-H1 inhibits IL-12 expression induced by LPS in RAW264.7 cells. Furthermore, PD-1 engagement on macrophages inhibits the expression of co-stimulatory molecules (CD80, CD86, MHC class Ⅰ,Ⅱ, CD11c) and T cell stimulatory capacity. In mouse primary B cells, we presumed that the PD-1 expression by LPS is induced through RP105 receptor. PD-1 engagement on B cells reduces cell proliferation and expression of activation-induced cytidine deaminase (AID) and inhibits the production of kappa light chain of mouse IgM, IgG2b, and IgE. Conclusions In this study, we demonstrated that PD-1 was expressed various immune cells isolated from spleen of LPS-induced mouse sepsis model and that PD-1 expression in macrophages and B cells is induced by LPS in vitro. PD-1 engagement with rmB7-H1 inhibits T cell stimulatory capacity of macrophages and reduces the production of antibodies in B cells. Therefore, we conclude that PD-1 on macrophages and B cells display the inhibitory function similar to that of T cell. This results indicate that the modulation of PD-1 expressed in innate immune cells as well as adoptive immune cells could be a crucial for the disease therapy using immune modulationKey words : Lipopolysaccharide (LPS), Macrophage, B cell, Programmed Death-1 (PD-1)
국문 초록Lipopolysaccharide 유도 동물 패혈증 모델에서 큰포식세포와 B 세포의 Programmed Death-1 발현과 기능 최 은 경(미생물학 전공)(지도교수 이 수 웅)의학과인제대학교 대학원 목적 PD-1은 다양한 면역활성 인자에 의해서 활성화된 T, B, NKT 세포 및 큰포식세포에서 발현되는 중요한 면역억제분자 중 하나이다. 최근 연구에서 PD-1 결손 생쥐는 Listeria 감염에 대해 우수한 선천면역 및 생존성 향상을 나타내어, 패혈증의 과정에 PD-1이 중요함을 예상할 수 있다. 이러한 패혈증 원인인 Lipopolysaccaride (LPS)와 같은 미생물 산물은 PD-1의 발현을 유도하는 중요 면역원으로 알려졌지만 이들에 의한 PD-1의 발현기전 및 비특이 면역세포에서의 기능에 관한 연구는 미비한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 LPS 유도 동물 패혈증 모델에서 조직유래 면역세포들의 PD-1 발현 및 생쥐 큰포식세포주(RAW264.7 cell line)와 비장유래 B 세포을 이용하여 LPS 자극에 의한 PD-1 발현기전 및 기능을 규명하고자 한다. 방법 C57BL/6 생쥐에 LPS를 주사한 후 비장세포를 분리하여 면역세포들에 발현된 PD-1을 유세포 분석기로 분석하였다. 생쥐 복강큰포식세포, 큰포식세포주(RAW264.7 cell line) 및 비장유래 B 세포에 LPS를 처리하여 PD-1의 발현을 RT-PCR, Western Blot으로 확인 하였다. 또한, reporter gene assay 및 다양한 신호전달 저해제를 이용하여 PD-1의 프로모터 영역 및 세포내 신호전달경로를 규명 하였다. ChIP assay 및 면역침강법을 이용하여 PD-1 발현에 중요한 전사조절인자를 규명 하였다. PD-1의 기능은 LPS에 의해 PD-1 발현이 유도된 세포를 리간드인 재조합 생쥐 B7-H1-Fc (rmB7-H1)단백질을 이용하여 분석 하였다. 결과 LPS 유도 동물 패혈증 모델의 비장에서 분리한 CD4 T 세포, B 세포 및 큰대식세포에서 PD-1 발현이 유도되며, 이들 중 B 세포에서 PD-1 발현이 매우 높게 유도됨을 확인하였다. 또한 생쥐복강유래 큰대식세포에서도 PD-1 발현이 매우 높게 유도됨을 알 수 있었다. 큰포식세포주인 RAW264.7 세포 및 생쥐비장유래 B 세포를 LPS로 처리했을 때 PD-1 발현이 유도됨을 확인하였다. PD-1 프로모터 분석에서 NF-kB 및 IRF-1 결합부위는 PD-1 발현에 중요한 전사조절부위임을 확인하였다. 또한 전사조절인자 NF-kB 및 IRF-1은 PD-1 발현에 공동으로 작용함을 ChIP assay와 면역침강법을 통해서 확인하였다. RAW264.7 세포주에서 LPS에 의해 증가된 IL-12 발현은 rmB7-H1에 의한 PD-1 활성에 의해서 억제되었다. 더군다나 rmB7-H1에 의한 PD-1의 활성은 대식 세포에 발현되는 공동자극분자들(CD80, CD86, MHC class Ⅰand Ⅱ, CD11c)의 발현을 억제하였으며, T 세포를 자극하는 큰포식세포의 기능을 저해하였다. 생쥐의 B 세포에서 LPS에 의한 PD-1 발현은 LPS 수용체인 RP105를 통해서 유도되는 것으로 추정된다. B 세포의 PD-1과 재조합 B7-H1의 결합은 LPS 자극에 의한 B 세포 성장과 activation-induced cytidine deaminase (AID)의 발현을 감소시켰고, B 세포가 분비하는 IgM, IgG2b, IgE의 kappa light chain 생산을 억제하였다. 결론 본 연구를 통해 LPS 유도 동물 패혈증 모델에서 유래한 다양한 면역세포에서 PD-1의 발현이 유도됨을 확인하였다. 또한 생쥐의 큰포식세포와 B 세포에서 PD-1의 발현은 LPS에 의해서 증가되는 것을 확인하였으며, PD-1과 재조합 B7-H1의 결합은 큰포식세포의 T 세포 자극능을 억제하였고, B 세포의 항체 생산능을 저하시켰다. 큰포식세포 및 B 세포에서의 PD-1 기능은 T 세포에서와 유사한 면역억제분자로 작용함을 알 수 있었다. 따라서 면역제어를 통한 질병치료에 적응면역세포 뿐만 아니라 선천면역세포에 발현된 PD-1의 발현제어는 중요하다고 할 수 있다. 중심단어 : Lipopolysaccharide (LPS), 큰포식세포, B 세포, Programmed Death-1 (PD-1)