부산대학교 도서관

감수분열에서 나타나는 상동재조합의 가장 중요한 역할 중 하나는 의도된 이중나선절단을 상동의 주형 DNA 가닥을 사용하여 수선하며 결과적으로 유전적 다양성을 가진 딸세포를 만드는 것이다. 이 과정에서 역할 하는 다양한 범위의 단백질들이 알려져 있다. 출아효모 (Saccharomyces cerevisiae)에서 Replication Protein A (RPA)는 이중나선절단이 Exo1 단백질에 의하여 절제되어 생기는 노출된 단일 가닥 DNA에 가장 처음으로 붙는 단백질이다. RPA는 세 가지의 하위 구성요소로 이루어져 있는데, 그것은 Rfa1, Rfa2, 그리고 Rfa3이다. 본 연구에서는 형광염색법과 현미경관찰을 통해 Rfa1의 새로운 역할을 제시하고있다. 기존 연구들에서 Rfa1은 순차적으로 다른 단백질과 상호작용하는 Rad51과 Dmc1 단백질로 교체되는 요소로 생각되어 왔다. 그러나 본 연구는 출아효모에서 형광염색 된 Rfa1 반점이 감수분열의 전 과정, 세사기(Leptotene), 접합기(Zygotene), 태사기(Pachytene)에 걸쳐 남아있는 것을 밝혀내었다. 또한 본 연구는 rfa1-119 돌연변이 균주를 도입하였는데, 이것은 야생 효모균과 비교하였을 때 45번째 Lysine이 Glutamic acid로 (K45E)바뀌었으며, 316번째 Asparagine이 Serine으로 (N316S)바뀐 것이다. 야생형 균주와 rfa1-119 돌연변이 균주의 비교를 통하여 본 연구에서 Rfa1과 Rad51의 상관관계와 Rfa1과 Zip3의 상관관계를 진전시켜 연구하였다. 본 연구에서 야생형 균주는 Rfa1 반점위에 포개진 Rad51 반점의 비율과 Zip3 반점 위에 포개진 Rfa1 반점의 비율이 확연하게 높다는 것을 관찰하였다. 그러나 이러한 반점들이 겹치는 모습이 rfa1-119 돌연변이 균주에서는 감소되었다. 나아가 본 연구는 rfa1-119 돌연변이 균주의 감수분열에서 Rfa1 반점의 증감률이 지연되는 것을 확인하였다. 본 연구는, 위의 결과들을 바탕으로, 교차 형성에서 기능할 수도 있는 태사기에서의 Rfa1의 새로운 역할의 존재에 대한 가능성을 제시한다. 또한 이 새로운 역할이 rfa1-119 돌연변이 균주에서는 감소하며, 이것은 Rfa1 단백질이 Rad51 단백질과 Dmc1 단백질이 Rfa1 단백질을 단일가닥 DNA로부터 떨어뜨리는 기능이 감소되었기 때문이고, 결과적으로 교차 형성 비율의 감소로 이어질 가능성이 있다. 뿐만 아니라 본 연구에서는 Pds5 단백질이 상동 DNA의 접합에서 가지는 기능을 Zip1, Zip3, Ctf19 단백질의 형광염색을 통해 연구하였다. 또한 Exo1 단백질의 접합복합체 형성과 염색체 축(Chromosomal axis) 형성에 관한 영향을 Rec8 단백질과 Zip1 단백질의 형광염색을 통해 연구하였다. 종합적으로, 본 연구는 감수분열의 초기 과정에 관한 신빙성 있는 새로운 기초를 제공하며 아직 밝혀지지 않은 Rfa1 단백질의 새로운 역할의 존재를 암시하고 있다.
Primary role of homologous recombination in meiosis is repairing programmed double strand breaks (DSBs) with homolog templates, that leads to generation of gametes with genetic diversity. Broad range of proteins that functions in this pathway have been revealed and characterized. In saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae), Replication Protein A (RPA) is the first protein that binds to exposed single strand DNA which is generated from resected DSBs by Exo1 protein. RPA comprise three subunits, Rfa1, Rfa2, and Rfa3. My study suggests existence of additional role of Rfa1 in budding yeast S. cerevisiae with immunofluorescence microscopy. In previous studies, Rfa1 has been thought as a factor that is replaced by sequential interplay between Rad51 and Dmc1 for homology search and single end invasion while interacting with other proteins. However, I identified that immunostained Rfa1 foci in S. cerevisiae remains and overlapped with Rad51, Zip3 throughout meiotic pathway, leptotene, zygotene, and pachytene. Furthermore, I adopted rfa1-119 mutants, which has mutation of 45th Lysine to Glutamic acid (K45E) and 316th Asparagine to Serine (N316S). K45E mutation is located in protein interaction domain and N316S is located in DNA binding domain B. With comparison between wile-type and rfa1-119 mutants, my study explored further relationship between Rfa1 and Rad51, and between Rfa1 and Zip3. I found that ratios of overlapped Rad51 foci on Rfa1 and overlapped Rfa1 foci on Zip3 are significantly higher in wild-type (WT) compared with rfa1-119 mutants where these overlapped foci formation has been thought to be disrupted. Further, I showed tendency of delayed turnover of Rfa1 foci in rfa1-119 mutant. With all these findings together, my study suggests additional, previously unknown role for Rfa1 in pachytene stage, maybe in crossover formation. My study also showed that of rfa1-119 is decreased, probably because of impaired dissociation of Rfa1 from single strand DNA by Rad51 and Dmc1. This results in decreased level of crossover. Moreover, my study further characterized the roles of Pds5 in homolog pairing by immunostaining of Zip1, Zip3, and Ctf19. And also my study characterized the effects of the Exonuclease I (Exo1) in Rad51 foci turnover as well as in synaptonemal complex (SC) formation and chromosomal axis building by quantifying Rec8 and Zip1 array formation. Overall, my study provides new aspects for early time meiosis pathway of S. cerevisiae and implies the existence of unsuspected role in Rfa1.