학술논문
Design, Synthesis, and Biological evaluation of a Novel Class of Keap1-Nrf2 Modulators and RGS4 inhibitors
Document Type
Dissertation/ Thesis
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English
Abstract
Redox-sensitive Kelch-like ECH-associated protein-1 (Keap1)-Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) pathway has been explored as a sensible target to ameliorate oxidative stress-induced pathological responses by the transient activation of Nrf2. Present study has practiced a Keap1-targeted therapeutic intervention method for the non-covalent inhibition of Keap1-Nrf2. Firstly, we designed and synthesized a novel benzothiophene, naphthalene, and quinazoline derivatives based on structure of known Nrf2 activators. However, these series did not show significant activity at Nrf2 cell based assay. Second, an integrated structure- and ligand-based design principles were applied to formulate feature-based pharmacophores that queried against the chemical databases. In vitro screening of the hits produced a potential hit compound, KKPA4026, superior to sulforaphane in terms of functional activity with an EC50 of 984 nM. This scaffold was further optimized by the docking of synthetically available analogs. As a result, we found KKPP0034, similar activity of KKPA4026. The compound KKPA4026 was further evaluated anti-inflammatory effects, western blot of Nrf2-targeted proteins, and in vivo anti-thrombotic effects of Nrf2 activators using a FeCl3-induced carotid arterial thrombosis model. We also tested drug-like properties of selected Nrf2 activators. These results led us to the design, synthesis, and biological evaluation of a novel class of Keap1-Nrf2 modulators. G protein-coupled receptors (GPCRs) are widely distributed throughout the body and are an important class of therapeutic targets for drug discovery. The regulator of G-protein signaling protein 4 (RGS4) accelerates the guanosine triphosphatase activity of G(αi) and G(αo), resulting in the inactivation of G-protein-coupled receptor signaling. Inhibitors of RGS proteins must block a protein–protein interaction (RGS-Gα). Recently, regulators of G protein signaling (RGS) proteins have emerged as potential therapeutic targets since they provide an alternative method of modulating the activity of G protein-coupled receptors. So we modified reported RGS4 inhibitor, CCG50014, and synthesized thioxothiazolidione derivatives. In vitro screening of this scaffold, these compounds shown activity at membrane translocation assay. We further tested in house libraries in vitro screening, and we found a novel scaffold for RGS4 inhibitors. In this study, we identified a novel class of RGS4 inhibitors, and further study are needed for evaluating inhibiting RGS4.
Keap1-Nrf2 pathway는 산화적 스트레스로 유발되는 여러 질환의 치료하기 위해 연구되고 있다. 이는 전사 인자인 Nrf2가 활성화되면 몸 속의 산화방지제 효소들을 발현시키고, 산화적 스트레스에 대한 세포 방어 시스템을 작동시켜 몸 안의 산화적 항상성을 유지시키는 기능을 하기 때문이다. 이번 연구에서는 Nrf2를 활성화시키기 위해 Keap1과 Nrf2 단백질 간의 상호작용을 non-covalent하게 저해하는 물질을 합성하는 연구를 수행하였다. 먼저, 보고된 Nrf2 활성물질을 기반으로 설계한 Benzothiophene, Naphthalene, Quinazoline 코어를 갖는 시리즈를 합성하였으나 in vitro Nrf2 cell based assay에서 좋은 활성을 나타내지 않았다. 다음 시도로, Keap1 단백질의 결정구조를 이용한 분자 모델링 선행 연구를 통해 KKPA4026 화합물을 도출하였고, 이 구조를 합성 가능한 아날로그로 유도체를 합성하여 생물학적 활성평가를 했다. 합성된 유도체들의 Structure-Activity Relationship (SAR) 연구 결과 KKPA4026과 유사한 활성을 갖는 화합물을 발견할 수 있었으며, 발견된 KKPA4026 화합물에 대해서는 추가적인 in vitro 실험을 하여 항염증 효과와 산화방지제 효소들의 단백질 레벨을 확인하였다. In vivo 모델로는 FeCl3로 유발되는 혈관손상 모델에서, 혈류지연을 지연시켜주는지에 관해 확인하였다. 그리고 대사안정성과 CYP 동효소 억제능 분석을 통해 약물로서의 성질도 확인하였다. 이 연구는 Keap1-Nrf2 조절제의 디자인, 합성, 생물학적 활성평가의 결과를 보였으며, 나아가 산화적 스트레스로 인한 질병의 치료에도 기여할 수 있을 것이라 기대한다.G 단백질 연결 수용체(G protein-coupled receptor, GPCR)는 세포막에 존재하는 단백질 중 가장 큰 대가족(superfamily) 수용체 군으로 세포 바깥으로부터 오는 신호를 세포 안으로 전달시켜주는 역할을 한다. 이들은 대부분의 생리적 기능 조절에 중요한 역할을 수행하고, GPCR 작용 리간드는 다양한 질병과 관계되어 있어 GPCR은 제약 시장에서 가장 주목 받는 약물 작용점으로 여겨지고 있다. G 단백질 신호 조절 단백질 4 (Regulator of G protein signaling 4, RGS4)는 G 알파 단백질에 결합하여 GTP 가수분해 효소를 활성화시키는 단백질로 작용하여 GPCR의 신호전달을 조절하는 단백질이다. G 단백질을 GDP가 결합된 형태로 변화시켜 GPCR 신호전달을 비활성화 상태로 만든다. 이를 억제하기 위해서는 RGS4 단백질과 G 알파 단백질 간의 상호작용을 억제해야 한다. 알려진 RGS4 억제제 CCG50014를 기반으로 설계한 Thioxothiazolidione 코어를 갖는 화합물을 합성하여, in vitro 실험 결과 두 가지 화합물에서 활성이 관찰되었으며, 인 하우스 라이브러리 스크리닝을 통해 몇 가지 시리즈에서 RGS4 억제제로 작용할 수 있는 새로운 구조를 발견할 수 있었다. 이 연구를 통해, RGS4 억제제로 작용할 수 있는 새로운 구조의 가능성을 보였으며, 발견된 화합물에 관하여 추가적인 in vitro, in vivo실험이 필요할 것으로 보인다.
Keap1-Nrf2 pathway는 산화적 스트레스로 유발되는 여러 질환의 치료하기 위해 연구되고 있다. 이는 전사 인자인 Nrf2가 활성화되면 몸 속의 산화방지제 효소들을 발현시키고, 산화적 스트레스에 대한 세포 방어 시스템을 작동시켜 몸 안의 산화적 항상성을 유지시키는 기능을 하기 때문이다. 이번 연구에서는 Nrf2를 활성화시키기 위해 Keap1과 Nrf2 단백질 간의 상호작용을 non-covalent하게 저해하는 물질을 합성하는 연구를 수행하였다. 먼저, 보고된 Nrf2 활성물질을 기반으로 설계한 Benzothiophene, Naphthalene, Quinazoline 코어를 갖는 시리즈를 합성하였으나 in vitro Nrf2 cell based assay에서 좋은 활성을 나타내지 않았다. 다음 시도로, Keap1 단백질의 결정구조를 이용한 분자 모델링 선행 연구를 통해 KKPA4026 화합물을 도출하였고, 이 구조를 합성 가능한 아날로그로 유도체를 합성하여 생물학적 활성평가를 했다. 합성된 유도체들의 Structure-Activity Relationship (SAR) 연구 결과 KKPA4026과 유사한 활성을 갖는 화합물을 발견할 수 있었으며, 발견된 KKPA4026 화합물에 대해서는 추가적인 in vitro 실험을 하여 항염증 효과와 산화방지제 효소들의 단백질 레벨을 확인하였다. In vivo 모델로는 FeCl3로 유발되는 혈관손상 모델에서, 혈류지연을 지연시켜주는지에 관해 확인하였다. 그리고 대사안정성과 CYP 동효소 억제능 분석을 통해 약물로서의 성질도 확인하였다. 이 연구는 Keap1-Nrf2 조절제의 디자인, 합성, 생물학적 활성평가의 결과를 보였으며, 나아가 산화적 스트레스로 인한 질병의 치료에도 기여할 수 있을 것이라 기대한다.G 단백질 연결 수용체(G protein-coupled receptor, GPCR)는 세포막에 존재하는 단백질 중 가장 큰 대가족(superfamily) 수용체 군으로 세포 바깥으로부터 오는 신호를 세포 안으로 전달시켜주는 역할을 한다. 이들은 대부분의 생리적 기능 조절에 중요한 역할을 수행하고, GPCR 작용 리간드는 다양한 질병과 관계되어 있어 GPCR은 제약 시장에서 가장 주목 받는 약물 작용점으로 여겨지고 있다. G 단백질 신호 조절 단백질 4 (Regulator of G protein signaling 4, RGS4)는 G 알파 단백질에 결합하여 GTP 가수분해 효소를 활성화시키는 단백질로 작용하여 GPCR의 신호전달을 조절하는 단백질이다. G 단백질을 GDP가 결합된 형태로 변화시켜 GPCR 신호전달을 비활성화 상태로 만든다. 이를 억제하기 위해서는 RGS4 단백질과 G 알파 단백질 간의 상호작용을 억제해야 한다. 알려진 RGS4 억제제 CCG50014를 기반으로 설계한 Thioxothiazolidione 코어를 갖는 화합물을 합성하여, in vitro 실험 결과 두 가지 화합물에서 활성이 관찰되었으며, 인 하우스 라이브러리 스크리닝을 통해 몇 가지 시리즈에서 RGS4 억제제로 작용할 수 있는 새로운 구조를 발견할 수 있었다. 이 연구를 통해, RGS4 억제제로 작용할 수 있는 새로운 구조의 가능성을 보였으며, 발견된 화합물에 관하여 추가적인 in vitro, in vivo실험이 필요할 것으로 보인다.