부산대학교 도서관

CHAPTER Ⅰ: 블루베리 껍질 추출물의 항비만 작용에 대한 연구비만은 지방 형태의 과도한 체중으로 정의 할 수 있고, 과거에 흔히 인식 되던 형태학적인 문제만이 아닌 당뇨병, 고지질혈증, 고혈압, 지방간은 물론, 심혈관계질환, 치매, 암 등의 발병과도 밀접하게 연관되며 충분히 생명에 지장을 줄 수 있는 심각한 건강질환이다. 또한 전 세계적으로 매년 비만인구가 급격히 늘어나면서 이제는 국제적 보건 문제로 대두되고 있는 가운데, 기존까지 사용되어 오던 여러 부작용을 동반하는 비만 치료 및 예방 약제들을 대체 할 수 있는 안정성이 보장된 천연 유래 신약개발에 많은 관심이 집중되고 있다. 천연계는 부작용이 없는 항비만 치료제를 탐색 하기에 매우 광범위한 자원이며 비만치료 및 예방에 대한 해결책이 될 것이라 전망한다. 블루베리는 북아메리카를 원산지로 미국, 독일, 뉴질랜드, 일본, 한국 중국 등에 분포되어 있는 진달래과 식물로써, 세계적으로 가장 인기있는 과실 중 하나이며, 푸른색으로 상징되는 안토시안 색소와 폴리페놀 성분을 다량 함유하고 있다. 이러한 블루베리는 일반적으로 안구 내부 망막의 로돕신(Rhodopsin) 색소체의 재합성 작용을 활성화 시키는 효능 외에도 안구 내에서 단백질과 당의 결합을 억제해 백내장을 예방 한다고 알려지면서 흔히 눈에 좋다고 잘 알려져 왔지만, 사실 그 외에도 암 순응에 대한 촉진 효과, 모세혈관 보호 작용, 항산화 작용, 비타민 P와 같은 작용 외에도 항당뇨, 항염증 등과 같은 다양한 약리학적 작용들을 가지는 것으로 보고되어 왔다. 본 연구에서는 블루베리 껍질 추출물에 대한 전반적인 항산화능을 분석하고, 그 항산화 활성에 의해 일어나는 3T3-L1 지방전구세포에서의 지방분화 억제 및 지질축적 억제 기작을 확인하였으며, 그와 동반된 동물실험에서도 고지방사료 급여를 통해 만들어진 비만 Rat 모델에서 실제 항비만 효과를 보이는지에 대해 연구하였다. 먼저 블루베리 껍질 추출물이 가지는 항산화능을 평가하기 위해 추출물의 총페놀과 총플라보노이드의 함량을 각각 측정하였고, 항산화능 평가의 지표들인 DPPH 소거활성, SRSA 소거활성 그리고 HRSA 소거활성을 확인하였다. 블루베리 껍질 추출물의 총페놀 및 총플라보노이드 분석에서, 추출물의 단위 g당 높은 케르세틴 동등값이 각각 검출 되었으며, DPPH 라디칼소거능 에서도 강한 소거능을 보였지만 양성대조군으로 사용된 아스코르빈산 보다는 비교적 낮은 수치를 보였다. 수퍼옥사이드 라디칼 소거능은 Nitroblue tetrazolium의감소를 통해 분석하였으며 추출물은 슈퍼옥사이드 라디칼의 발생을 효과적으로 억제하였다. 하이드록실 라디칼 소거능에서도 역시 추출물은 효과적인 항산화능을 보였지만 대조군에 비해서는 떨어지는 수치를 보였다. 세포실험을 위해서 섬유아세포 유래 3T3-L1 지방전구세포를 배양 하였으며, 여러 지방분화 유도물질을 사용하여 지방세포의 분화를 일으킴과 동시에 블루베리 껍질 추출물을 세포에 저농도와 고농도로 각각 처리 하여 지방세포 분화의 중간시점인 4일과 최종분화 시점인 7일동안 각각 노출 시킨 후, 지방세포 내에 축적된 Triglyceride의 양을 측정하여Triglyceride Level을 확인하였고, 지방세포상의 지질성분만을 염색 시키는 Oil Red O staning기법을 이용하여 Triglyceride가 축적 되어진 정도를 광학현미경과 육안을 통해 관찰하였다. 그 후 분자생물학적인 접근을 위해 지방세포 내에서 특이적으로 발현되는 여러 유전자들의 mRNA 및 단백질 발현량을 RT-PCR과 Wedtern-blot 기법을 통해 각각 확인하였으며, 더 나아가 지방세포의 분화에 매게되는 Kinase signaling pathway들의 인산화에 대해 블루베리 껍질 추출물이 어떠한 영향을 가하는지 관찰 하였다. 그 결과, 지방세포로 분화 유도된 3T3-L1 지방전구세포에서의 Triglyceride의 축적은 블루베리 껍질 추출물의 처리에 의해 농도 의존적으로 유의성 있게 억제되는 것이 관찰 되었다. 지방세포의 분화 조절에 연관되는 여러 Adipogenic gene들인 PPARγ, C/EBPβ, C/EPBα 유전자의 mRNA 및 단백질 발현량은 블루베리 껍질 추출물의 농도에 비례하여 눈에 띄게 감소하였으며 지방세포의 표현형을 결정짓는 유전자들인 aP2 와 FAS 유전자의 단백질 발현도 블루베리 껍질 추출물에 의해 동일한 패턴을 보였다. 또한 지방세포의 분화와 매게되는 kinase 들인 AKT 와 GSK3β 의 인산화는 블루베리 껍질 추출물의 처리 및 비처리 구에서 모두 동일한 발현을 보인 Total form과는 달리 블루베리 껍질 추출물의 농도에 비례하여 감소되는 것을 각각 확인 할 수 있었다.동물실험을 위해 5주령된 SD Rat 을 이용 하였으며, 고지방 사료를 급여시켜 비만마우스 모델을 확립하였고 음성 대조군에는 일반사료를 급여 시켰으며, 고지방식이와 동반된 블루베리 껍질 추출물 급여 그룹은 저농도 및 고농도 그룹으로 나뉘어 총 4그룹으로 분류 하였다. 그룹 설정 후 1주일간 동물들을 환경에 적응 시켰으며, 1주에 한번 모든 개체들의 체중을 기록하였다. 동물실험의 마지막 날 최종 체중 및 부고환주변 지방조직과 등체벽 내장지방의 무게를 측정하고, 혈액을 채취하여 혈청내 Total-cholesterol과 HDL-cholesterol및 Triglycerid의 수치를 확인 하였다. 동물실험결과 블루베리 껍질 추출물은 고지방식이로 유도시킨 비만 Rat의 체중 증강과 체내의 지방조직들의 형성을 농도의존적으로 억제하였으며, 혈청내의 Lipid cotents 함량 또한 블루베리 껍질 추출물의 농도에 비례하여 유의적으로 개선되었다. CHAPTER Ⅱ : 개똥쑥 추출물을 이용한 항비만 효과에 대한 연구비만은 고지질혈증, 진성당뇨, 지방간증, 아테롬성 동맥 경화증, 그리고 심혈관계 질환 등과 같은 여러 대사성질환을 일으키는 주요 위험 인자이며, 유전적 요인과 환경적 요인, 서구적인 식사습관, 편리해진 생활로 인해 섭취되는 칼로리에 비해 사용 되어지지 않는 칼로리 등이 주요 원인이라 보고되고 있다. Adipogenesis(지질생성)는 CCAAT/enhancer binding protein-δ (C/EBPδ), CCAAT/enhancer binding protein-β (C/EBPβ), CCAAT/enhancer binding protein-α (C/EPBα), peroximal proliferator-activated receptor-γ (PPARγ)와 같은 지방세포의 성장을 이끄는 주요 전사인자들과, fatty acid synthase (FAS)나 fat acid binding protein (aP2) 등과 같은 지방세포 특이적 유전자들에 의해 조절되고 유지된다. 특히 PPARγ와 C/EPBα는 지방세포의 분화 프로그램에서 가장 중심적인 역할을 담당하는 전사인자로서, 서로간의 발현을 활성시킴과 동시에 여러 지방세포 특이 유전자들의 발현을 지속적 으로 유도해 나간다. 따라서, 이들 PPARγ와 C/EPBα 유전자의 조절은 항비만 연구의 주요 타겟이 된다. 개똥쑥(Annual wormwood leaf)은 우리나라를 비롯한 일본, 타이완, 몽골, 시베리아 등지에 주로 분포되어 있는 국화과 식물로, 한의학에서 발열감기, 소화불량 등에 사용되고 있고, 특히 말라리아 치료제로 잘 알려져있는 외에도 항암, 항염, 항균 등의 작용을 한다는 연구 보고들이 있으나 항비만 기작에 관한 구체적인 연구성과는 아직 없다. 본 연구는 개똥쑥 추출물들을 HPLC 기법을 통해 성분분석 하고, 분석된 유효성분들이 3T3-L1 cell에서의 지방분화와 지질축적에 대한 억제능력을 가지는지를 확인 하였으며 그에 따른 명확한 분자적인 기전을 규명 하고자 하였다. 또한 동물실험을 통해서 체중 감소 및 생체내 지방조직 형성 억제, 그리고 혈중 지질성분 생성 방지에 직접적인 작용을 보이는지에 대해 평가하였다. HPLC를 통한 성분분석 결과, 개똥쑥 추출물에는 페놀 및 플라보노이드물질인 2-amino-3,4-dimethyl-benzoic acid, p-coumaric acid, Morin hydrate, Rutin등이 각각의 리액션 타임에서 확인 되었다. 세포실험을 위해 3T3-L1 지방전구세포를 배양하였으며, 지방세포내 지방분화 및 지질생성을 일으키는 여러 물질들을 처리하여 세포의 지방화를 유도하였고, 그와 동반하여 개똥쑥 추출물을 저농도처리구와 고농도처리구로 각각 처리 하였다. 3T3-L1 지방전구세포가 지방세포로 최종 분화 하는데 까지 걸리는 시간을 고려하여, 처리 시간을 4일과 7일로 각각 분류하여 실험하였다. 3T3-L1에서의 지질생성을 확인하기 위한 Oil Red O staning 기법에서, 지질물들의 염색된 수준이 개똥쑥 추출물의 농도가 증가함에 따라 감소되는 것을 관찰하였으며, 세포내 Triglyceride의 수치 또한 개똥쑥 추출물의 농도에 비례하여 줄어드는 것이 확인 되었다. 개똥쑥 추출물 처리에 의해 일어나는 3T3-L1 미분화 지방세포에서의 이러한 변화들에 대한 분자적 기전을 조사하기 위해 RT-PCR과 Western blot 기법을 실행 하여, 여러 지방세포 특이 유전자들인 C/EBPβ, C/EPBα, PPARγ, FAS, aP2 유전자들의 mRNA발현 및 단백질 발현량을 각각 확인하였다. 개똥쑥 추출물은 이들 유전자들의 mRNA 발현을 눈에띄게 억제시켰으며, 이러한 발현량의 감소는 단백질 차원에서도 동일한 패턴을 나타내었다. 또한 동일한 기법을 통해 지방세포 분화 관련 kinase signaling pathway를 확인하였고 AKT와 GSK3β의 인산화 또한 개똥쑥 추출물의 농도에 비례하여 비활성화 되는 것이 확인되었고, Wild type의 AKT와 GSK3β는 개똥쑥 추출물의 처리 및 비처리 세포에서 모두 동일한 발현량을 보였다. 동물실험을 위해서 4주령된 SD Rat을 사용 하였으며, 일반사료 급여 그룹, 고지방사료 급여그룹, 그리고 고지방사료 급여와 동반하여 개똥쑥 추물물을 급여 시킨 그룹으로 나누어 총 3그룹으로 설정하여 실험에 임하였다. 그룹 분류 후 동물들은 1주일 동안의 적응기간을 가졌으며, 총 5주동안 각각의 사료 및 추출물을 급여 시켰고, 물의 급여량은 모든그룹을 동일하게 하였다. 각 그룹의 사료 섭취량은 매일 기록하였으며 각 그룹간에 동물들의 체중 변화를 살피기 위해 실험 첫째날을 시작으로 최종일 까지 매주 체중을 기록하였다. 동물 실험 최종일에, 혈청 내의 Triglyceride, Total cholesterol, HDL-cholesterol의 농도를 확인하기 위해 모든 개체들의 혈액을 채취하였으며, 원심분리 후 혈청만을 이용해 혈액화학검사를 실시하였다. 체내의 지방조직의 형성되는 정도를 관찰하기 위해 부고환 주변지방조직 및 등체벽쪽 내장지방을 모두 동일한 부위에서 채취하여 무게를 확인하였으며, 지방조직의 형태적 차이를 비교하기 위해 각 개체들의 동일 부위의 지방조직을 10% formalin에 고정시킨 후, H.E staning 기법을 통해 광학현미경으로 관찰하였다. 혈액내의Triglyceride과 Total cholesterol의 농도는 양성 대조군인 고지방급여 그룹에 비해 고지방사료와 동반하여 개똥쑥 추출물을 급여 시킨 그룹에서 유의성 있게 감소되는 것을 확인 할 수 있었으며, 그와 대조적으로 HDL-cholesterol의 수치는 개똥쑥 급여로 인해 눈에 띄게 높은 수치를 나타내었다. 또한 동물들의 최종적인 체중 및 지방조직의 무게는 음성대조군으로 사용된 일반사료를 급여 시킨 그룹에 비해, 양성 대조군인 고지방 사료 급여 그룹에서 크게 증가되었고, 이러한 동물들의 비만화는 개똥쑥 추출물 급여에 의해서는 눈에 띄게 감소된 수치를 보였으며, 모든 그룹의 사료 섭취량 및 물 섭취량은 동일하였다. H.E staning을 통해 지방조직의 형태적인 변화를 비교한 연구에서도, 고지방사료만을 급여 시킨 그룹과 비교 하였을 때, 개똥쑥을 함께 급여시킨 그룹에서 상대적으로 지방세포의 크기가 줄어 든다는 것을 관찰할 수 있었다. 결과적으로, 개똥쑥 추출물은 지방세포의 성장을 조절하는 주요 유전자들의 활성을 유의성 있게 비활성화 시키고, 생체에서 혈중 지질 성분들의 생성을 억제 하였으며, 체중의 증강 및 체내에서의 지방조직의 형성을 방지하여 효과적인 항비만화 작용을 한다는 것이 본 연구를 통해 관찰되었다.
Obesity is a worldwide epidemic with multiple obesity-associated health problems including type 2 diabetes, hypertension, and cardiovascular disease. Obesity is induced by increased adipose tissue mass, which results from the multiplication of fat cells through adipogenesis and increased deposition of cytoplasmic triglyceride. Excess adipose tissue leads to obesity with its associated diseases to cause serious health problem. In the present study, I examined the anti-obesity effect and mechanism of action of blueberry peel extracts (BPE) in 3T3-L1 cells and high-fat diet (HFD)-induced obese rats. The levels of lipid accumulation were measured, along with the changes in the expression of genes and proteins associated with adipocyte differentiation in 3T3-L1 cells. BPE treatment significantly reduced lipid accumulation, a marker of adipogenesis, in a dose-dependent manner. BPE decreased the expression of the key adipocyte differentiation regulator C/EBPβ, as well as the C/EBPα and PPARγ genes, during the differentiation of preadipocytes into adipocytes. Moreover, BPE down-regulated adipocyte-specific genes such as aP2 and FAS compared with control adipocytes. The specific mechanism mediating the effects of BB revealed that insulin-stimulated phosphorylation of Akt was strongly decreased, and its downstream substrate, phospho-GSK3β, was downregulated by BPE treatment in 3T3-L1 cells. Together, these data indicated that BPE exerted anti-adipogenic activity by inhibiting the expression of PPARγ and C/EBPβ and the Akt signaling pathway in 3T3-L1 adipocytes. Next, we investigated whether BPE attenuated HFD-induced obesity in rats. Rats that were put on an HFD plus BPE were significantly lighter and comparable to the body weights of rats on a normal diet. The epididymal or perirenal adipose tissue weights were lower in rats on an HFD plus BPE compared with the tissue weights of HFD-induced obese rats. The serum total cholesterol and triglyceride levels in the rats fed BPE were modestly reduced, and the HDL-cholesterol level was strongly increased in HFD plus BPE-fed rats compared with the levels in HFD-fed rats. Taken together, these results demonstrated an inhibitory effect of BPE on adipogenesis through the down-regulation of C/EBPβ, C/EBPα, and PPARγ and the reduction of the phospho-Akt adipogenic factor in 3T3-L1 cells. Moreover, BPE reduced body weight gain and inhibited fat accumulation in an HFD-induced animal model of obesity. Next, we examined the mechanism of Artemisia annua L.(AAL)-induced adipocyte differentiation and adipogenesis in 3T3-L1 cells. Moreover, we evaluated the influence of AAL on body weight, epididymal fat and perirenal fat weight, and lipid profiles in obese rats fed a high-fat diet. HPLC analysis showed that the AAL contained 15.9 mg/g p-coumaric acid and 5.25 mg/g rutin. The treatment of AAL effectively prevented triglyceride accumulation during adipogenesis in a dose-dependent manner. Consistently, AAL suppressed the differentiation of 3T3-L1 preadipocytes into adipocytes through the down-regulation of DMI-induced Akt activation and expression of adipogenic genes including CCAAT/enhancer binding protein-α (C/EBPα) and peroximal proliferator-activated receptor-γ (PPARγ). Moreover, the expression aP2, which is a known PPARγ-target gene, was down-regulated by AAL treatment. Consistent with the inhibitory effect of AAL on adipocyte lipid accumulation, an in vivo study indicated that AAL prevented obesity in HFD-induced obese rats. Body weight of rats fed a HFD was lowered by 25% following administration of AAL compared to the HFD alone group. Reduced weight gain in AAL-fed rats was accompanied by a reduction in the weights of epididymal and perirenal adipose tissues. We also observed that AAL administration resulted in the improvement of numerous serum metabolic parameters, decreasing serum TG, TC, and increasing HDL-C levels, which are used as an indicator of adipocyte lipolysis. In addition, histological examination showed smaller fat cells in the epididymal fat tissue of the AAL-fed group in comparison to that in the HFD alone group, indicating that the decreased body weight gain was due to the reduced accumulation of fat. In summary, our data demonstrated that AAL suppressed 3T3-L1 adipogenic differentiation via the inhibition of Akt phosphorylation and C/EBPs and PPARγ expression. Moreover, AAL attenuated HFD-induced weight gain, fat deposition, and adipose cell size, and alleviated serum Total-cholesterol, Triglyceride, and HDL-cholesterol levels. These results suggest that AAL may be an effective therapeutic agent to prevent obesity and related metabolic disorders.