학술논문
小鼠Usp2基因序列分析、真核表达载体构建和启动子功能鉴定 / Sequence Analysis,Eukaryotic Expression Vector Construction,and Promoter Function Identification of Usp2 Gene in Mouse
Document Type
Academic Journal
Author
张宇; 李超; 马天天; 马白荣; 李丹; 周栋; 靳亚平; 陈华涛; ZHANG Yu; LI Chao; MA Tian-tian; MA Bai-rong; LI Dan; ZHOU Dong; JIN Ya-ping; CHEN Hua-tao
Source
中国兽医杂志 / Chinese Journal of Veterinary Medicine. 59(9):49-59
Subject
Language
Chinese
ISSN
0529-6005
Abstract
为了分析小鼠泛素特异性蛋白酶2(USP2)2种主要转录本(Usp2-45和Usp2-69)及其编码蛋白的理化特性,构建Usp2-45真核表达载体和Usp2启动子荧光素酶报告质粒,探究生物钟系统对Usp2不同转录本启动子的调控作用,本试验利用在线软件对小鼠Usp2-45和Usp2-69基因进行生物信息学分析;克隆Usp2-45基因的蛋白编码序列(CDS)并构建pcDNA3.1-Usp2-45-Flag重组载体,转染至小鼠NIH3T3胚胎成纤维细胞后,利用实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹技术检测Usp2-45在mRNA和蛋白水平的表达;扩增Usp2-45和Usp2-69的启动子片段,并构建其荧光素酶报告质粒,通过双荧光素酶报告试验检测Usp2启动子对生物钟核心转录因子脑肌类芳香烃受体核转位蛋白1(BMAL1)和昼夜运动输出周期蛋白(CLOCK)的应答活性;通过构建不同长度的Usp2-45启动子荧光素酶报告质粒鉴定其生物钟转录调控功能区.结果显示,小鼠USP2-45和USP2-69蛋白均为不稳定蛋白,亲水性强,无跨膜区域和信号肽,且基因的CDS区高度保守;pcDNA3.1-Usp2-45-Flag重组质粒的酶切和测序结果与预期一致,转染重组质粒组的Usp2-45在mRNA和蛋白水平的表达均显著高于对照组(P＜0.01).双荧光素酶报告试验结果显示,Usp2-69启动子对BMAL1/CLOCK无应答活性,而不同长度的Usp2-45启动子对BMAL1/CLOCK均具有显著应答活性,活性由强到弱依次为1 368、2 004和998 bp.结果表明,本试验系统分析了小鼠USP2的理化性质和结构特性,成功构建了 pcDNA3.1-Usp2-45-Flag真核表达载体,初步鉴定了生物钟系统选择性调控Usp2-45节律性转录的启动子功能区.