학술논문
小鼠输卵管上皮类器官的构建及表型验证 / Establishment and phenotype verification of mouse oviductal epithelial organoids
Document Type
Academic Journal
Author
Source
上海交通大学学报（医学版） / Journal of Shanghai Jiaotong University(Medical Science). 43(7):848-859
Subject
Language
Chinese
ISSN
1674-8115
Abstract
目的·构建野生型(wild type,WT)小鼠和miR-34b/c-/-且miR-449-/-双敲除(double knockout,dKO)小鼠输卵管上皮类器官的培养体系,并进行表型验证.方法·利用酶消化法和差速贴壁法分离纯化WT小鼠和dKO小鼠输卵管上皮细胞,并利用免疫荧光法鉴定得到的输卵管上皮细胞的纯度;通过计数和直径测量比较WT小鼠和dKO小鼠输卵管上皮类器官数量、生长速度和生长大小;利用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,H-E)染色和透射电子显微镜(透射电镜)对输卵管上皮类器官进行形态和结构观察;采用免疫荧光法观察并统计纤毛细胞和分泌细胞在WT小鼠和dKO小鼠输卵管上皮类器官中的比例;采用免疫组织化学法、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和Western blotting检测分泌细胞、纤毛细胞相关基因在输卵管上皮类器官中的表达.结果·分离纯化得到的输卵管上皮细胞纯度较高.与WT小鼠相比,dKO小鼠输卵管上皮类器官生长更快,体积更大,数量也更多;但dKO小鼠输卵管上皮类器官发育较慢,于培养28 d时才出现上皮内陷,而WT小鼠的类器官于培养16 d时已经出现.H-E染色和透射电镜结果显示输卵管上皮类器官呈现出与在体输卵管类似的结构.免疫荧光检测显示dKO小鼠输卵管上皮类器官的纤毛细胞显著减少而分泌细胞显著增多(均P<0.05).免疫组织化学法检测结果显示,dKO小鼠输卵管上皮类器官的分子表达模式与在体输卵管组织基本一致,即纤毛细胞标志物乙酰化微管蛋白α(Ac-α-tubulin)、叉头框J1(forkhead box J1,FOXJ1)表达减少,分泌细胞标志物配对盒8(paired box 8,PAX8)表达增加;RT-qPCR结果显示dKO小鼠输卵管上皮类器官中Foxj1和微管蛋白β4A(tubulin β class Ⅳa,Tubb4a)的mRNA水平均降低(均P<0.05),而Pax8 mRNA水平升高(P<0.05);Western blotting结果显示,dKO小鼠类器官中FOXJ1的蛋白表达水平显著降低,PAX8表达显著升高(均P<0.05).结论·研究成功构建WT小鼠和dKO小鼠的输卵管上皮类器官培养体系,该体系可模拟小鼠在体输卵管的表型.