부산대학교 도서관

目的 探究磷脂酰肌醇-3-激酶/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(phosphatidylinositol-3-kinase/serine-threonine kinase,PI3K/Akt)信号通路对小鼠胚胎神经发育的影响及作用机制,进一步阐明PI3K/Akt信号通路相关胚胎神经发育异常的分子机制.方法 实验动物为C57BL/6J小鼠,胚胎第 7.5 天(embryonic day,E7.5)孕鼠随机分为6 组,实验组分别腹腔注射12.5、25、50、75、100 mg/kg的LY294002(PI3K/Akt信号通路抑制剂),对照组注射生理盐水.E13.5 解剖,观察小鼠胚胎畸形情况.确定最佳造模剂量后,取该组小鼠胚胎神经及脊柱样本,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测细胞凋亡及音猬因子(sonic hedgehog,Shh)信号通路关键基因的mRNA表达水平,采用免疫印迹法检测蛋白质表达水平.实验细胞选用小鼠神经干细胞NE-4C细胞系,采用噻唑兰法(methylthiazolyldiphenyl tetrazolium bromide,MTT)检测不同浓度LY294002 处理后细胞存活情况;采用原位末端标记(TdT-mediated dUTP nick-end labeling,TUNEL)实验检测细胞凋亡;采用流式细胞术检测细胞周期.统计学方法采用单因素方差分析和Dunnett's t检验.结果 动物实验结果显示,LY294002 给药组出现神经管畸形(neural tube defect,NTD)表型;50 mg/kg组的NTD发生率 80.7%(46/57),均为脊髓脊膜膨出和脊柱裂,选为最佳造模剂量.RT-qPCR结果显示,与对照组相比,给药无畸形组、脊髓脊膜膨出组及脊柱裂组的细胞凋亡标志物肿瘤抑制基因(tumor suppressor gene P53,P53)和半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶 3(cysteinyl aspartate-specific proteinase 3,Caspase3)的相对mRNA表达均上升(P<0.01),磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸-3-激酶催化亚基α基因(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate-3-kinase catalytic subunit alpha,PIK3CA)及Shh信号通路关键基因[平滑蛋白(smoothened,Smo)、神经胶质瘤相关癌基因同源物(glioma-associated oncogene homolog,Gli)1 及Gli2]的相对mRNA表达均显著降低(P<0.01).免疫印迹结果显示,与对照组相比,给药无畸形组、脊髓脊膜膨出组和脊柱裂组的PI3K、Gli2 相对蛋白表达均降低(P<0.01);脊髓脊膜膨出组和脊柱裂组的Smo、Gli1相对蛋白表达均降低(P<0.01),但给药无畸形组与对照组比较差异无统计学意义.细胞实验结果显示,LY294002 抑制细胞增殖,细胞周期阻滞在G1 期,诱导NE-4C细胞凋亡.MTT检测结果显示,随着LY294002浓度的增大,对细胞存活的抑制作用越强.TUNEL染色结果显示,20 μmol/L与25 μmol/L处理组中阳性细胞数与总细胞数的比例均高于对照组(4.22±0.16、8.56±0.24、1.00±0.14,t值分别为 6.225 和 15.089,P值均<0.001).流式细胞术检测结果显示,随着LY294002浓度增加(0、20、25 μmol/L),G1 期细胞占总细胞的百分比显著升高[(53.1±3.1)%、(66.4±2.1)%、(76.3±1.6)%,F=31.627,P<0.001],S期与G2 期细胞比例逐渐减少.结论 在小鼠胚胎神经发育过程中,抑制PI3K/Akt信号通路导致Shh信号通路传导受到抑制,促进细胞凋亡,影响小鼠胚胎神经管闭合,导致NTD的发生.