부산대학교 도서관

目的:探讨紫菀酮对体外破骨细胞分化和活性的影响及作用机制.方法:①分析紫菀酮对核因子-κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL)诱导Raw 264.7细胞向破骨细胞分化的影响.将Raw 264.7细胞分为空白对照组、阳性对照组、紫菀酮1 μmol·L-1干预组、紫菀酮2.5 μmol·L-1干预组、紫菀酮5 μmol·L-1干预组和紫菀酮10 μmol·L-1干预组,空白对照组加入完全培养基,阳性对照组加入含25 ng·mL-1RANKL的完全培养基,其余各组分别加入含有相应浓度紫菀酮及25 ng·mL-1RANKL的完全培养基,培养5 d后进行抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)染色,统计各组破骨细胞数;②分析紫菀酮对Raw 264.7细胞活力的影响.将Raw 264.7细胞分为空白对照组、紫菀酮1 μmol·L-1干预组、紫菀酮2.5 μmol·L-1干预组、紫菀酮5 μmol·L-1干预组和紫菀酮10 μmol·L-1干预组,空白对照组加入完全培养基,其余各组分别加入含有相应浓度紫菀酮的完全培养基,分别培养48 h、120 h后测定各组细胞活力;③分析紫菀酮对破骨细胞纤维状肌动蛋白环形成的影响.将Raw 264.7细胞分为空白对照组、阳性对照组、紫菀酮5 μmol·L-1干预组和紫菀酮10 μmol·L-1干预组,空白对照组加入完全培养基,阳性对照组加入含25 ng·mL-1RANKL的完全培养基,紫菀酮5 μmol·L-1干预组和紫菀酮10 μmol·L-1干预组分别加入含有相应浓度紫菀酮及25 ng·mL-1RANKL的完全培养基,培养5 d后采用鬼笔环肽和4',6-二脒基-2-苯基吲哚染色,观察各组破骨细胞纤维状肌动蛋白环形成情况.④分析紫菀酮对核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)转录活性的影响.将稳定转染pGL4.32[luc2P/NF-KB-RE/Hygro]载体的RAW 264.7细胞分为空白对照组、阳性对照组和紫菀酮10 μmol·L-1干预组,空白对照组及阳性对照组加入完全培养基,紫菀酮10 μmol·L-1干预组加入终浓度为10 μmol·L-1紫菀酮的完全培养基;培养2 h后,阳性对照组及紫菀酮10 μmol·L-1干预组分别加入RANKL溶液,使培养基中RANKL的终浓度为25 ng·mL-1;继续培养6 h后,检测各组细胞荧光素酶的荧光强度.⑤分析紫菀酮对核因子-κB抑制蛋白激酶α亚基(inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase subunit α,IKBα)蛋白表达的影响.将Raw 264.7细胞分为阳性对照组和紫菀酮10 μmol·L-1干预组,每组6孔,分别编号1～6.待细胞贴壁后,阳性对照组加入完全培养基,紫菀酮10 μmol·L-1干预组加入终浓度为10μmol·L-1紫菀酮的完全培养基,继续培养2 h后,在2组的1号孔加入RANKL溶液使RANKL终浓度为25 ng·mL1,在1号孔加入RANKL溶液后30 min、40 min、50 min、55 min,分别在2号、3号、4号、5号孔加入RANKL溶液至RANKL终浓度为25 ng·mL-1.在1号孔加入RANKL后60 min,收集各孔细胞,采用蛋白印迹法检测IκBα蛋白的表达量.⑥分析紫菀酮对破骨细胞特异性基因转录的影响.将Raw 264.7细胞分为阳性对照组、紫菀酮5 μmol·L-1干预组和紫菀酮10 μmol·L-1干预组.阳性对照组加入含25 ng·mL-1RANKL的完全培养基,紫菀酮5 μmol·L-1干预组和紫菀酮10 μmol·L-1干预组分别加入含有相应浓度紫菀酮和25 ng·mL-1RANKL的完全培养基,培养5 d后,收集各组细胞,采用实时定量PCR检测组织蛋白酶K、空泡型ATP酶d2亚基(vacuolar ATPase subsnit D2,V-ATPase d2)、TRAP 的 mRNA 表达量.⑦分析紫菀酮对活化 T-细胞核因子c1(nuclear factor of acti-vated T cells c1,NFATc1)蛋白表达的影响.将Raw 264.7细胞分为阳性对照组和紫菀酮10 μmol·L-1干预组,每组4孔,分别编号1～4.待细胞贴壁后,阳性对照组加入完全培养基,紫菀酮10 μmol·L-1干预组加入终浓度为10 μmol·L-1紫菀酮的完全培养基.继续培养2 h后,在2组的1号孔加入RANKL溶液使RANKL终浓度为25 ng·mL-1,在1号孔加入RANKL溶液后2 d、4 d,分别在2号、3号孔加入RANKL溶液使RANKL终浓度为25 ng·mL-1.在1号孔加入RNAKL后5 d,收集各孔细胞.采用蛋白印迹法检测NFATc1蛋白的表达量.结果:①紫菀酮对RANKL诱导Raw 264.7细胞向破骨细胞分化影响的分析结果.空白对照组之外的5组破骨细胞数比较,差异有统计学意义[(187.667±14.503)个,(180.000±14.422)个,(174.333±11.060)个,(152.667±5.033)个,(130.667±11.015)个,F=11.767,P=0.001].紫菀酮 10 μmol·L-1 干预组、紫菀酮 5μmol·L-1干预组破骨细胞数均少于阳性对照组、紫菀酮1 μmol·L-1干预组和紫菀酮2.5 μmol·L-1干预组(P=0.004,P=0.000;P=0.017,P=0.000;P=0.047,P=0.001);紫菀酮10 μmol·L-1干预组破骨细胞数少于紫菀酮5 μmol·L-1干预组(P=0.044).②紫菀酮对Raw 264.7细胞活力影响的分析结果.紫菀酮干预48 h、120 h时,5组Raw 264.7细胞活力比较,组间差异均无统计学意义(48 h:0.960±0.101,0.938±0.051,0.916±0.072,0.915±0.079,1.009±0.105,F=0.647,P=0.641;120 h:1.347±0.161,1.388± 0.047,1.423±0.473,1.398±0.067,1.357±0.034,F=0.400,P=0.805).③紫菀酮对破骨细胞纤维状肌动蛋白环形成影响的分析结果.与空白对照组比较,阳性对照组、紫菀酮5 μmol·L-1干预组和紫菀酮10 μmol·L-1干预组均可见破骨细胞和纤维状肌动蛋白环;与阳性对照组比较,紫菀酮5 μmol·L-1干预组和紫菀酮10 μmol·L-1干预组破骨细胞纤维状肌动蛋白环形成均受到抑制,且其受到抑制的程度随紫菀酮干预浓度增加而增强.④紫菀酮对破骨细胞NF-κB转录活性影响的分析结果.3组荧光素酶相对荧光强度比较,组间差异有统计学意义(0.058±0.003,1.000±0.044,0.753±0.040,F=613.132,P=0.000).阳性对照组和紫菀酮10 μmol·L-1干预组的荧光素酶相对荧光强度高于空白对照组(P=0.000,P=0.000),紫菀酮10 μmol·L-1干预组的荧光素酶荧光强度低于阳性对照组(P=0.000).⑤紫菀酮对IκBα蛋白表达影响的分析结果.2组破骨细胞IκBα蛋白相对表达量随诱导时间延长均呈先下降后上升趋势,但2组的趋势不完全一致(1.000±0.000,0.414±0.171,0.285±0.104,0.132± 0.021,0.157±0.038,0.802±0.066,F=49.839,P=0.000;0.980±0.130,0.632±0.102,0.347±0.037,0.302±0.070,0.546± 0.142,1.502±0.345,F=21.435,P=0.000);诱导20 min、30 min、60 min,紫菀酮 10 μmol·L-1干预组破骨细胞 IκBα 蛋白相对表达量高于阳性对照组(t=-4.018,P=0.016;t=-4.586,P=0.010;t=-3.444,P=0.026).⑥紫菀酮对破骨细胞特异性基因转录影响的分析结果.3组破骨细胞V-ATPase-d2、组织蛋白酶K、TRAP的mRNA表达量比较,组间差异均有统计学意义(1.000± 0.089,0.879±0.100,0.530±0.054,F=25.553,P=0.001;1.000±0.030,0.725±0.153,0.719±0.111,F=6.293,P=0.034;1.000±0.326,0.834±0.030,0.656±0.327,F=88.003,P=0.000).紫菀酮 5 μmol·L-1 干预组破骨细胞组织蛋白酶 K、TRAP的mRNA表达量均低于阳性对照组(P=0.023,P=0.001);紫菀酮10 μmol·L-1干预组破骨细胞V-ATPase-d2、TRAP的mRNA表达量均低于紫菀酮5 μmol·L-1干预组和阳性对照组(P=0.000,P=0.002;P=0.000,P=0.000);紫菀酮10 μmol·L-1干预组破骨细胞组织蛋白酶K的mRNA表达量低于阳性对照组(P=0.021).⑦紫菀酮对NFATc1蛋白表达影响的分析结果.2组破骨细胞NFATc1蛋白相对表达量随诱导时间延长均呈上升趋势,但2组的上升趋势不完全一致(1.000±0.000,1.175±0.007,4.700±0.742,19.430±1.763,F=250.352,P=0.000;1.042±0.035,1.334±0.290,3.531±0.583,15.690±0.823,F=525.669,P=0.000);诱导后5 d,紫菀酮10 μmol·L-1干预组破骨细胞NFATc1蛋白相对表达量低于阳性对照组(t=3.329,P=0.029).结论:紫菀酮能够抑制体外破骨细胞的分化和活性,其作用机制与抑制NF-κB和NFATc1信号通路有关.