학술논문
Functional Characterization of ObgC as a Chloroplast-targeting Obg GTPase in Mono- and Dicotyledonous Plants
Document Type
Dissertation/ Thesis
Source
Subject
Language
English
Abstract
The Spo0B-associated GTP-binding protein (Obg) GTPase, has diverse and important functions in bacteria, including initiation of sporulation, morphological development, DNA replication, ribosome maturation and maintenance of ppGpp at steady-state level during exponential growth phase. The Obg proteins are relatively well conserved in a wide range of organisms, from bacteria to eukaryotes. Homologs of the Bacillus subtilis Obg are also found in plants, but their primary role in plants remains unknown. In this study, it is characterized that the Obg proteins in mono- and dicotyledonous plants are the highly conserved at chloroplasts, and named as ObgC. Moreover, functional characterization of Arabidopsis and rice obgc mutants strongly underlies the evolutionarily conserved role of ObgC in various organellar physiological processes, such as ribosome biogenesis, cpDNA replication as well as ppGpp-mediated stress response. The mutants exhibited a chlorotic phenotype, caused by retarded chloroplast development, implying that plant ObgC is essential for leaf greening. Loss-of-function mutation in ObgC led to a severe suppression of protein biosynthesis by affecting plastid rRNA processing. It was also demonstrated through rRNA profiling that plastid rRNA processing was broken-down in obgc mutants, resulting in impaired ribosome biogenesis. The sucrose density gradient profiles revealed a defective chloroplast ribosome maturation of obgc mutants. In addition, AtObgC was co-precipitated with 23S rRNA, suggesting its association with plastid 50S ribosomal subunit.Furthermore, rice OsObgC1 mutant lines exhibited hypersensitivity to DNA replication inhibitor hydroxyurea (HU). Quantitative PCR results showed that the ratio of chloroplast DNA to nuclear DNA at the copy number of the mutants was higher than that of wild-type plants. After DAPI staining, OsObgC1 mutants showed abnormal nucleoid architecture. The specific punctate staining pattern of ObgC-GFP signal implies that this protein localizes to the chloroplast nucleoids. Ribosomal proteins, L13 and L11 exhibited the similar pattern of subcellular localization. It supports that ObgC regulates the assembly of ribosomal large subunit in the plastid nucleoids.Next, the Obg-SpoT interaction is vital to control intracellular ppGpp levels for bacterial responses to environmental cues. However, the relationship between Obg-SpoT interaction and ppGpp levels in plants, remains elusive. The interaction analysis of AtObgC with AtRSH1, a plant homolog to the bacterial RelA/SpoT, was performed to confine their binding sites using yeast two-hybrid assay. Expression analyses of AtObgC and AtRSH1 under wounding and high salinity conditions, supported that both genes were positively correlated in ppGpp-mediated stresses response. Based on this, it was assumed that to lessen their interaction frequency by maintenance of reduced mRNA levels of AtObgC and AtRSH1 in the chloroplasts may be required for high ppGpp accumulation. Our findings here indicate that the ObgC retains almost all the multiple functions of prokaryotic Obg. Especially, this study provides a significant insight that plant ObgC may regulate diverse physiological processes during chloroplast development.
Spo0B-associated GTP-binding protein인 Obg GTPase는 sporulation을 위하여 Spo0B 유전자의 downstream에 결합하며, bacteria의 형태 형성이나, DNA 복제, ribosome의 숙성 그리고 대수증식기간중 ppGpp량을 유지하는데 있어서 매우 중요한 역할을 할 것으로 알려져 있다. 이러한 Obg 단백질은 bacteria로부터 식물, 동물에 이르는 진핵 생물까지 광범위하게 잘 보존 되어 있다. 하지만, 이러한 광범위한 분포, 특히 bacteria Obg의 homologs가 식물체에서도 발견이 되고 있지만, 식물체내에서의 그들의 주된 역할은 거의 밝혀져 있지 않은 상황이다.본 연구에서는 단자엽과 쌍자엽의 대표식물이라고 할 수 있는 벼와 애기장대의 엽록채내에서 bacteria의 Obg와 단백질 서열의 유사성이 높은 유전자를 분리하고 ObgC로 명명 하였으며 그 기능을 규명하고자 하였다. 이들 obgc 돌연변이체를 사용한 기능 분석 결과 ribosome의 생성, cpDNA의 복제 그리고 ppGpp가 매개된 stress 반응을 포함한 다양한 세포 내 기관들의 생리작용에 ObgC 유전자가 그 역할을 담당하고 있을 것으로 판단되었다. 또한, ObgC의 기능 손실 돌연변이체의 잎은 백화현상을 보이기도 하였는데, 이는 전자현미경 관찰 결과 엽록체의 발달이 지연되고 있음이 원인이었다. 이 결과로 부터 판단해 볼 때, 식물의 ObgC는 잎의 엽록체 발달에 필수적인 역할을 할 것으로 예상되었다. 더우기 ObgC 기능 손실 돌연변이체는 plastid rRNA processing에 영향을 줌으로써 엽록체내에서의 단백질 합성을 저해하였다. 이와같은 사실은 rRNA profiling에 의해 증명이 되었는데, obgc 돌연변이체의 경우 plastid rRNA processing이 제대로 이루어지지 못함이 관찰되었고, 이로인해 ribosome에 문제가 생겼음을 알 수 있었다. Sucrose density gradient profiling 실험에서는 obgc 돌연변이체에서 엽록체의 ribosome 생성 결함이 드러났다. 뿐만 아니라, AtObgC은 50S ribosomal subunit인 23S rRNA와 함께 co-precipitation 되었는데. 이로부터 plastid 50S ribosome과 회합될 수 있을 것으로 예상해 볼 수 있었다.한편, 벼OsObgC1 돌연변이체는 DNA 복제 억제제인 hydroxyurea (HU)에 대해 과민성을 보였다. Quantitative PCR을 통해, 엽록체의 DNA의 핵의 DNA에 대한copy수의 비율을 비교해본 결과, 야생형에 비해 돌연변이체에서 그 비율이 높게 나타났으며, 또한 DAPI staining 실험에서는 OsObgC1 돌연변이체가 비정상적인 nucleoid 구조를 가짐을 관찰할 수 있었다. 뿐만 아니라 GFP-tagging 방법으로 관찰 되었던 punctate staining pattern은 ObgC-GFP 단백질이 엽록체의 nucleoid에 분포함을 의미하는 결과로 보였다. Ribosomal protein인 L13과 L11의 subcellular localization 역시 유사한 분포 pattern을 나타내었다. 이로써 ObgC 단백질은 plastid nucleoid에서ribosome의large subunit의 assembly를 조절하는 중요한 단백질이라는 사실을 뒷받침 해준다. 다음으로, bacteria의 경우 Obg 단백질은 SpoT와의 상호작용을 통해 환경적 변화에 대응하며 세포 내 ppGpp 수준을 조절하는데 있어서 매우 중요한 것으로 잘 알려져 있다. 하지만 아직까지 식물체 내의 ppGpp 수준의 변화와 Obg-SpoT 상호 작용과의 관계는 아직 잘 밝혀져 있지 않다. 이를 알아보기 위해 먼저 AtObgC와 RelA/SpoT의 식물 homolog인 AtRSH1 단백질과의 상호작용 여부를 yeast two-hybrid 실험 방법을 통해 알아보고자 하였다. In planta 조건에서 AtObgC 와 AtRSH1 유전자 사이의 기능적 관련성을 알아보기 위해, 고염 및 wunding을 처리한후, 이들 유전자의 발현 분석을 해본 결과, ppGpp가 매개된 경우의 스트레스 반응과 매우 유사한 결과를 보여주었는데, 이를 바탕으로 유추해 보면, 엽록체에서 높은 수준으로 ppGpp를 축적 하기 위해서는 AtObgC와 AtRSH1의 mRNA 감소를 통해 그들의 상호작용 빈도를 줄이게 될 것으로 보인다.지금까지의 결과를 종합해 보면 ObgC 단백질은 단자엽 및 쌍자엽 식물의 엽록체 내에 존재하며, bacteria와 같이 매우 다양한 생물학적인 기능을 수행할 수 있을 것으로 추정된다. 특히 본 연구에서는 ObgC 유전자가 식물쳉내의 가장 중심부위인 엽록체의 발달과정에서 매우 중요한 생리적 작용을 할 것으로 판단 되었다.
Spo0B-associated GTP-binding protein인 Obg GTPase는 sporulation을 위하여 Spo0B 유전자의 downstream에 결합하며, bacteria의 형태 형성이나, DNA 복제, ribosome의 숙성 그리고 대수증식기간중 ppGpp량을 유지하는데 있어서 매우 중요한 역할을 할 것으로 알려져 있다. 이러한 Obg 단백질은 bacteria로부터 식물, 동물에 이르는 진핵 생물까지 광범위하게 잘 보존 되어 있다. 하지만, 이러한 광범위한 분포, 특히 bacteria Obg의 homologs가 식물체에서도 발견이 되고 있지만, 식물체내에서의 그들의 주된 역할은 거의 밝혀져 있지 않은 상황이다.본 연구에서는 단자엽과 쌍자엽의 대표식물이라고 할 수 있는 벼와 애기장대의 엽록채내에서 bacteria의 Obg와 단백질 서열의 유사성이 높은 유전자를 분리하고 ObgC로 명명 하였으며 그 기능을 규명하고자 하였다. 이들 obgc 돌연변이체를 사용한 기능 분석 결과 ribosome의 생성, cpDNA의 복제 그리고 ppGpp가 매개된 stress 반응을 포함한 다양한 세포 내 기관들의 생리작용에 ObgC 유전자가 그 역할을 담당하고 있을 것으로 판단되었다. 또한, ObgC의 기능 손실 돌연변이체의 잎은 백화현상을 보이기도 하였는데, 이는 전자현미경 관찰 결과 엽록체의 발달이 지연되고 있음이 원인이었다. 이 결과로 부터 판단해 볼 때, 식물의 ObgC는 잎의 엽록체 발달에 필수적인 역할을 할 것으로 예상되었다. 더우기 ObgC 기능 손실 돌연변이체는 plastid rRNA processing에 영향을 줌으로써 엽록체내에서의 단백질 합성을 저해하였다. 이와같은 사실은 rRNA profiling에 의해 증명이 되었는데, obgc 돌연변이체의 경우 plastid rRNA processing이 제대로 이루어지지 못함이 관찰되었고, 이로인해 ribosome에 문제가 생겼음을 알 수 있었다. Sucrose density gradient profiling 실험에서는 obgc 돌연변이체에서 엽록체의 ribosome 생성 결함이 드러났다. 뿐만 아니라, AtObgC은 50S ribosomal subunit인 23S rRNA와 함께 co-precipitation 되었는데. 이로부터 plastid 50S ribosome과 회합될 수 있을 것으로 예상해 볼 수 있었다.한편, 벼OsObgC1 돌연변이체는 DNA 복제 억제제인 hydroxyurea (HU)에 대해 과민성을 보였다. Quantitative PCR을 통해, 엽록체의 DNA의 핵의 DNA에 대한copy수의 비율을 비교해본 결과, 야생형에 비해 돌연변이체에서 그 비율이 높게 나타났으며, 또한 DAPI staining 실험에서는 OsObgC1 돌연변이체가 비정상적인 nucleoid 구조를 가짐을 관찰할 수 있었다. 뿐만 아니라 GFP-tagging 방법으로 관찰 되었던 punctate staining pattern은 ObgC-GFP 단백질이 엽록체의 nucleoid에 분포함을 의미하는 결과로 보였다. Ribosomal protein인 L13과 L11의 subcellular localization 역시 유사한 분포 pattern을 나타내었다. 이로써 ObgC 단백질은 plastid nucleoid에서ribosome의large subunit의 assembly를 조절하는 중요한 단백질이라는 사실을 뒷받침 해준다. 다음으로, bacteria의 경우 Obg 단백질은 SpoT와의 상호작용을 통해 환경적 변화에 대응하며 세포 내 ppGpp 수준을 조절하는데 있어서 매우 중요한 것으로 잘 알려져 있다. 하지만 아직까지 식물체 내의 ppGpp 수준의 변화와 Obg-SpoT 상호 작용과의 관계는 아직 잘 밝혀져 있지 않다. 이를 알아보기 위해 먼저 AtObgC와 RelA/SpoT의 식물 homolog인 AtRSH1 단백질과의 상호작용 여부를 yeast two-hybrid 실험 방법을 통해 알아보고자 하였다. In planta 조건에서 AtObgC 와 AtRSH1 유전자 사이의 기능적 관련성을 알아보기 위해, 고염 및 wunding을 처리한후, 이들 유전자의 발현 분석을 해본 결과, ppGpp가 매개된 경우의 스트레스 반응과 매우 유사한 결과를 보여주었는데, 이를 바탕으로 유추해 보면, 엽록체에서 높은 수준으로 ppGpp를 축적 하기 위해서는 AtObgC와 AtRSH1의 mRNA 감소를 통해 그들의 상호작용 빈도를 줄이게 될 것으로 보인다.지금까지의 결과를 종합해 보면 ObgC 단백질은 단자엽 및 쌍자엽 식물의 엽록체 내에 존재하며, bacteria와 같이 매우 다양한 생물학적인 기능을 수행할 수 있을 것으로 추정된다. 특히 본 연구에서는 ObgC 유전자가 식물쳉내의 가장 중심부위인 엽록체의 발달과정에서 매우 중요한 생리적 작용을 할 것으로 판단 되었다.